转SV40大T抗原基因昆虫细胞系的研究

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1、河北农业大学硕士学位论文转SV40大T抗原基因昆虫细胞系的研究姓名：田建肖申请学位级别：硕士专业：农业昆虫与害虫防治指导教师：李国勋20040620摘要昆虫细胞作为重组病毒的受体能成功高效地表达外源基因，生产具有重要医用价值、具备天然活性的生物工程制品，从而使昆虫细胞培养倍受青睐。目前，可以通过转基因的方法改良现有细胞，从而获得高产昆虫杆状病毒和外源蛋白的昆虫细胞系。本研究用磷酸钙转染法和电穿孔两种方法，分别将SV40病毒的大T抗原基因转入第80代的Tn581—4细胞，经G418筛选，克隆，共得到转基因细胞克隆株62·株。通过细胞传代，选出生长且状况良好的克隆株共有54株。54株细胞系分别

2、经PBS，AMD处理，病毒滴度和多角体产量比较筛选出10个细胞克隆株：Tn5B．1。l、Tn5B．1．12、Tn5B一1—15、Tn5B-l一25、Tn5B．1-26、Tn5B—I-30、Tn5B—l一33、Tn5B．2．3、Tn5B一2．9及Tn5B．2．12，这些细胞系分别接种昆虫病毒TnGV、TnNPV、MsNPV、PiNPV，其中仅Tn5B．1．12对所测的所有NPV病毒敏感．将此转基因细胞系命名为Tn5B．SV一40(简写为Tn5B一40)。Tn5B-40细胞形态主要为纺锤形和圆形，贴壁生长，大小为18．5×42l-tm。增殖很快，群体倍增时间为22小时，最大生长密度可达2．2X

3、106cells／ml。对AcMNPV病毒感染率达95％，多角体产量平均为115OBs／eell，是一株高产杆状病毒的细胞系。Tn5B-40有较强的营养抗逆性，细胞在无营养的PBS盐缓冲液中1天以后，Tn5B一40细胞有70％存活，比野生型Tn581—4细胞高出30％，第5天时，Tn581．4细胞全部死亡，Tn5B一40到第6天仍然有5％存活细胞。用含不同浓度放线菌素D的培养基处理Tn5B一40细胞l小时。当放线菌素D浓度为O_3I，O．62，1．25和2．5gtg／ml时，Tn5B一40细胞的存活率分别比Tn581—4高出38％，50％，60％和35％，当浓度高达5ug／ml时，Tn58

4、1—4细胞全部死亡而Tn5B一40细胞仍有30％的生存率。说明此细胞具有抗凋亡的特性。Tn5B一40是一株高表达重组蛋白的昆虫细胞系。用重组病毒AcMNPV一0．gal侵染细胞，Tn5B一40细胞内B一半乳糖苷酶的产量明显高于野生型细胞系，到第六天，其表达水平达到Tn5BI一4的2．3倍，第8天时比Tn581．4细胞高出35％，达3．4×104IU／ml。随着时间的延长，Tn5B一40培养基中酶量也逐渐增加，第4天就比第2天提高了5倍。第8天时TnfB-40细胞内和培养基中的酶总表达水平达到最高5．4X1．0”U。lml。AcMNPV—SE。4,P感染此细胞，其细胞内的分泌型碱性磷酸酶表达

5、水平明显低于培养基中的表达水平，最高只达1IU／ml。Tn5B．40细胞分泌在培养基中的SEAP在细胞培养后期较高，第9天时比Tn581．4高出25％。Tn5B一40的SEAP总表达水平最高值达到5．7IU／ml。昆虫病毒AcMNPV在Tn5B一40细胞中离体传代lO次，病毒未出现继代效应，其病毒滴度、多角体形态及产量、杀虫毒力均无明显变化。Tn5B一40细胞是昆虫杆j状病毒离体复制的优良细胞系。关键词：SV40大T抗原；Tn581—4细胞；转基因细胞系；B一半乳糖苷酶；分泌型碱性磷酸酶StudyonTransformedInsectCellLineswithSV40LTAntigenPo

6、stgraduate：TianJianxiaoMajor：AgricultureinsectandpestcontrolAdvisor：LiGuoxunAbstractTogeneratestablecelllineswiththeSV40largeT(LT)antigen，Tn5B!一4cellswastransfectedwithplasmidsPIE—SV一【TandpAciel—NeobyusingCa3(P04)2andelectroporationmethodsatpassage80．ThetransfectedcellswasfirstlyselectedinG418-con

7、tainingmedium．Weobtained62clonesfromthefirstselectionaftercellclone．Afterseveralpassages，55ofeellcloneswereexaminedfortheirresistancetonutritionalstressinPBSandAMD(Iug／m1)．10cloneswhichappearedstrongresistancetoP