白桦成花计时基因的研究

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1、摘要实验旨在利用RT—PcR技术克隆白桦(Betulaplatyphalla)的成花计时相关基因，从而为揭示强化条件_卜白桦提早开花结实的基因调控机理奠定基础。实验探讨了克隆成花计时基因最佳的取材时间是，每年的5月末到6月初，顶端分生组织向花原基转变时的一个星期内集中进行，具体时间随每年温度变化做适当调整。克服了常规方法和试剂盒无法提取出富含酚类化合物、多糖和一些尚无法确定的次级代谢产物的自桦花芽组织RNA的障碍，提出了3种白桦雄花芽组织RNA的提取方法：CTAB、CTAB--DNA酶消化法和SDS--DNA酶消化

2、法。对这3种方法比较后，确定本实验采用CTAB--DNA酶消化法和SDS--DNA酶消化法提取白桦雄花芽组织的总RNA。建立白桦花芽组织RNA的逆转录体系。通过优化扩增体系和扩增程序后，初步建立了克隆白桦成花计时基因的RT-PCR技术体系。利用生物信息学的技术和相关软件，共设计出7对克隆白桦成花计时基因的简并引物。经过筛选，1号简并引物较合适(PS5’--ARAARGCNCAYGARAT，PA5’一RCATCCANGGNGGCAT)。对1号简并引物扩增出的3条特异性条带进行了回收、克隆和测序：与国际核苷酸数据库进行

3、了同源性比较，对特异性片段的功能进行初步的分析和确定。{结果发现分子量最大的片段(长675bp)与成花计时基因同源性较低，而与植物发育过程中的果胶酶基因具有80％同源性，而且局部片段对比分值达184；通过蛋白质三维结构预测发现，它具有明显的功能结构域。据此，可初步确定此片段是白桦果胶酶基因的部分片段。其它两条片段测序时出现信号重叠，需做进一步分析和研究。Jq／f～f‘关键词：白桦／成花基I刊战花计时基因基因克隆同源序列基因虹固生物信息学AbstractThisresearchisconcernedtocloneth

4、eflower—timinggenesofBetulaplatyphallaundertileintensiveconditionbyorthologusgenecloningtechnique．Thepurposeistoreveal1hecontrolmechanismofearlyfloweringgenesofthisspecies，andalsotoanalyzesomespecialgene’sexpressioninthatcondition．1'hebesttimetocollectthemater

5、ialsforcloningisdiscussedinthispaper,whichisfromtheendofMaytothebeginningofJuneeachyear．Itmeansthereisonlyaweekforthematerialstotransitfromapexdividingtissuetoflowerinflorescence，butstillalittlechange、~ithtemperatureeveryyear．Sincetherearemorethingsinthebudtis

6、sueofthemaleflower,suchasphenoliccompounds，polysacchrides，proteinsandsomeothersecondarymetabolites，threemethodsusedtoisolateRNAaretestedinthisassay，whicharetheenzymedigestingmethodsofCTAB，CTAB—DNAandSDS—DNAAtlast，CTAB—DNAandSDS—DNAmethodsareusedinthisexperimen

7、t，OnthebasisofoptimizingexperimentprocedureandPCRsystemofthematerials，theinitialreversiontranscriptionsystemandorthologusgenecloningtechniqueareestablishedSevenpairsofdegeneracyprimersforcloningareschemedoutbyusingBioinformaticssoftware．Afterselection，onepairo

8、fprimer0"401：PS5"--ARAARGCNCAYGARAT，PA5、RCATCCANGGNGGCAT、iSusedtodoPCRamplificationintheexperimentThreespecialbandsasPCRproducts，obtainedbyusingprimerNo．1，arereclaimed，andthenusedt