大豆脂肪氧合酶纯化及同工酶特性比较研究

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1、上海海洋大学硕士学位论文大豆脂肪氧合酶纯化及其同工酶特性比较摘要脂肪氧合酶(Lipoxygenase，简称LOX：EC1．13．11．12)是影响食品风味和色泽最重要的酶之一。本文对大豆种子中脂肪氧合酶的提取最适条件，如酶提取液的pH，表面活性剂Triton的浓度以及硫酸铵分步沉淀的饱和度等进行了摸索；采用凝胶层析技术对LOX进行纯化，分离得到大豆LOX的两种同工酶，并对它们的特性，包括最适温度和pH，热稳定性和酸碱稳定性，米氏常数l(III值，金属离子和有机试剂对酶活性的影响等进行了较为系统的比较研究。本文还对大豆脂肪氧合酶的

2、抑制剂进行了筛选，包括BHA、BHT、儿茶酸、Vc等，同时选取了其中抑制效果较好的抑制剂应用于豆浆的制作，并通过感官评定方法评定它们对大豆腥味的消除作用。采用浓度为50mmol／L不同pH的磷酸缓冲液作为提取液提取大豆LOX的结果显示，pH6．8提取液的提取效果较为理想，LOX酶活力和比活力都达到最高，并且通过在4℃下的贮藏实验，该酶在3天内表现高度的稳定性。采用50mmol／L，pH6．8的磷酸缓冲液，添加不同浓度的TtitonX-100进行大豆LOX的提取试验，实验结果表明，当triton浓度达到2％时，提取液的LOX酶活力

3、和比活力都有很大的提高。当继续增加triton浓度时，酶活力上升幅度减小，比活力反而下降。采用含2％TtitonX-100的50mmol／LpH6．8磷酸缓冲液所提取的粗酶液，以不同饱和度的硫酸铵进行沉淀实验，发现采用饱和度为20％和40％的硫酸铵对酶液进行分步沉淀后得到的浓缩酶液，LOX的比活性较粗酶液提高了将近3倍。粗酶液经过硫酸铵分步沉淀后，进一步用SephadexG一200柱层析纯化，分离到两个具有LOX活力洗脱峰，并收集对应的洗脱液，分别记为LOX-I和LOX-2。LOX-I的比活力比粗酶液提高了52．1倍，LOX一2

4、的比活力比粗酶液提高了48．6倍。同工酶特性研究表明，同工酶LOX-I和LOX-2的最适pH分别为7．0和9．O。LOX一1和LOX一2的最适温度均为25℃。LOX-I和LOX一2在0-30℃间均表现出高的热稳定性。LOX一1和LOX-2的米氏常数(1(Ⅲ)分别为8．2mmol／L和12．2mmol／L。同工酶LOX一1和LOX一2对金属离子的敏感性也不同。Fe3+对LOX—l具有抑制作用，而对LOX一2不起作用。Mn2+和Na+对LOX-I和LOX一2均有抑制作用。Ca2+对LOX-1具有激活作用，而对LOX一2却具有抑制作用

5、。Cu2+对LOX一1有激活作用，而对LOX一2没有作用。T上海海洋大学硕士学位论文实验结果表明，巯基乙醇(ME)和表面活性剂SDS对LOX-1和LOX一2的酶活性都有较强的抑制作用。大豆LOX的抑制剂筛选结果显示，丁羟基茴香醚(BHA)、BHT、正二氢愈创木酸(NDGA)、6，7一二羟香豆素(Esculeitin)、二羟肉桂酸(caffeicacid)、儿茶酸(Catechin)和表儿茶酸(epicatechin)对LOX有很强的抑制作用，浓度在lmmol／L时即可抑制LOX一1、LOX一2和LOX的全部酶活力。Vc、没食子酸

6、(galloylgallicacid)、生育酚(V。)、氯化钠(NaCl)对LOX同工酶也有不同程度的抑制作用。儿茶酸和表儿茶酸对LOX的抑制作用最为显著，在0．1mmol／L时即可抑制LOX一1、LOX一2和LOX90％以上的活力。考虑食品安全的因素，选择抑制剂NGDA和儿茶酸等进行大豆豆浆豆腥味消除实验。感官评定结果表明，采用经过抑制剂溶液处理后的大豆样品制作的豆浆在风味和色泽方面都有很大的改善。关键词：大豆脂肪氧合酶，同工酶，纯化，特性II上海海洋大学硕士学位论文PurificationofSoybeanLipoxygen

7、aseandComparisonsofthePropertiesofitsIsoenzymesABSTRACTLipoxygenase(Lox，EC1．13．11．12)isoneofthemostimportantenzymesthateffecttheflavorandcoloroffoods．Inthepaper,theoptimumconditionsforisolatinglipoxygenasefromsoybearlseeds，includingthepHandtheconcentrationsofsurfacta

8、ntTritoninextractionbufferandtheconcentrationofammoniumsulfateforprecipitatingtheenzymeetc，wereresearched．xlcVhenthesoybeanLOXwaspu