药物对巨噬细胞作用的特征和信号传导

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1、南开大学硕士学位论文药物对巨筮细胞作用的特征和信号传导姓名：李晓东申请学位级别：硕士专业：生物物理指导教师：杨文修20030501摘要本论文以大鼠腹腔巨噬细胞(PMcp)为研究对象，利用MTT法检测TNFa释放量；利用激光共聚焦显微镜和显微荧光分光光度计检测胞内钙离子浓度(【Caz+】i)的动态变化，对中药有效成分大黄素(Emodin)和大黄酸(Rhein)影响正常的和内毒素(LPS)刺激的PM(p的作用机制进行了研究。结果表明，LPS诱发PM9单细胞[ca2+]i升高呈高幅值宽时程的峰状动力学，其升高【ca2+]。首先来源于胞内cd+释

2、放，随后引发胞外Ca2+内流。随着LPS剂量的增加，[ca_1i峰值升高、上升速度加快、时程缩短；50蚓ml出现超最大剂量抑制现象。PTx可使PMm的TNFa释放量增加，1．0ng／ml达到基础值的2．54倍。12．0jxmol／L的PKA抑制剂H7抑制了PTx释放n盯Ⅱ作用的95．6％。PTx可抑制LPS活化PM／p释放TNFa，100ng／ml时抑制了LPS刺激的耵师a释放的32．5％，说明了PKA的活化在LPS刺激的巨噬细胞信号传导网络中的双向作用。Emodini删[cdqi升高和TNFa的释放可被H7抑制，12．0邶nol／L完全

3、抑制了Emodin10’5mol／L诱发的[Ca”1i峰值，并抑制了TNFa释放的93．2％。说明Emodin通过提高PKA的活性，升高PM9『Ca2+]i和释放TNFd。Emodin剂量依赖性地抑制LPS升高PMcp单细胞『Ca2+]i的动态变化，10-5mol／L抑制了69．2％的主峰值。且Emodin对LPS引起的早期胞内钙释放和随后的胞外钙内流均有抑制作用。Emodin对PKC激活剂PMA升高【ca2+】。和促TNF旺释放有剂量依赖性的抑制作用，10。mol／L时使PMA刺激的【ca2+]i高峰消失，平均幅值较高峰下降了70．6％

4、，同时抑制了PMA促TNFa释放作用的65．7％。表明Emodin抑制LPS作用的信号传导通路中包括对PKC活性的抑制。Rhein可轻度升高PMcp[ca2+】i，104mol／L诱发的【ca2十]i峰是基础值的1．2倍，且在胞外无钙时转变为周期性振荡，这种振荡是由调控胞内钙释放的网络产生的。Rhein剂量依赖性地强烈抑制LPS升高PM币单细胞[ca_1．，使LPS诱发的【Ca2+】．高幅值峰转变为低幅值振荡动力学，10‘5mol／L使LPS诱发的[cali峰值平均下降了78．7％，对胞内Ca2+释放的抑制是其抑制[cali升高的早期机制

5、。Rhein对PMA升高PM9单细胞fCa2+1i和促TNFⅡ释放均有剂量依赖性的强烈抑制作用，10。5mol／L的Rhein基本抑制了PMA诱发的两个[ca2十】i峰和释放TNFa作用的80．1％。表明Rhein显著抑制PKC通路活性包括在其抑制LPS作用的信号传导通路中。关键词：巨噬细胞肿瘤坏死因子内毒素大黄素大黄酸细胞内自由钙离子浓度AbstractByusingMTTassayandfluorescencespectrophotometerorlaserscanningconfocalmicroscopy，themechanism

6、sofEmodinahdRheinon【Ca2'I】idynamicsandTNFaproductioninnormalandLPS—stimulatedratperitonealmacrophages(PMcp)wereinvestigated．LPSinducedhigh-amplitude‘plateau-shaped’peakof【C∥+】iinPM牛．C一+releasefromintracellularpoolswasevokedfirst．andthenCa2+influxwasinvolved．Wj血thehigherco

7、ncentrationofLPS，therewashigheramplitude，higherincreasingrateandshorterduration．PTxinduced2．54一foldTNFareleasefromPM∞attheconcentradonof1．0ng／ml，AsaninhibitortoPKA．H712．0tool／Linhibited95．6％releaseofTNFQstimulatedbyPTx．ItisdemonstratedthatthePTxactivatedPKAcaninhibittheTN

8、FareleaseinducedbyLPS，whichindicatethebiphaseregulationeffectofPKAinthesignalingpathwaysstimulat