化疗药物CPT-11对腹腔巨噬细胞和B1细胞的长期毒性作用研究

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1、暨南大学硕士学位论文题名（中英对照）：化疗药物CPT-11对腹腔巨噬细胞和B1细胞的长期毒性作用研究ProlongedDeleteriousInfluencesofChemotherapeuticAgentCPT-11onResidentPeritonealMacrophagesandB1Cells作者姓名：白文静指导教师姓名及学位、职称：欧阳东云博士研究员学科、专业名称：免疫学学位类型：学术学位论文提交日期：2018年6月4日论文答辩日期：2018年6月8日答辩委员会主席：廉哲雄教授论文评阅人：学位授予单位和日期：暨南大学年月日暨南大学硕士学位论文化疗药物CPT-11对腹腔巨噬细胞和B1细胞

2、的长期毒性作用研究*硕士研究生白文静专业免疫学导师欧阳东云研究员暨南大学生命科学技术学院免疫生物学系摘要目的：CPT-11（伊立替康）是治疗肠癌的一线化疗药物。腹腔巨噬细胞与B1细胞是腹腔内最重要的两类组织定居的固有免疫细胞，两者之间相互关联，共同维护胃肠固有免疫稳态。此前的研究发现，CPT-11对肠上皮和腹腔巨噬细胞有毒害作用。经CPT-11化疗后，药物对腹腔固有免疫细胞的损伤，以及损伤后后是否可以自我修复尚不清楚。为此，在本课题中我们进行了四方面的研究：其一，检测腹腔注射CPT-11对腹腔固有免疫细胞（包括腹腔巨噬细胞和B1细胞）表型和数量的影响；其二，同品系小鼠腹腔细胞和骨髓细胞过继到C

3、PT-11腹腔给药处理后的小鼠后，检测后者腹腔巨噬细胞和B细胞的表型和数量；其三，CPT-11灌胃处理，对腹腔巨噬细胞和B细胞数量的影响；其四，检测CPT-11腹腔给药处理对抵抗大肠杆菌Escherichiacoli感染的免疫能力（生存率）的影响。旨在进一步明确CPT-11对固有免疫细胞的毒性作用，为有效减轻化疗药物的毒副作用、优化化疗方案提供实验参考数据。方法：1.动物实验：C57BL/6（6-8周龄）小鼠适应性养殖一周后，将小鼠分为3组，分别为Control组、Vehicle组和CPT-11组，其中CPT-11组腹腔注射CPT-11I暨南大学硕士学位论文（200mg/kg），Vehicle

4、组注射等量溶剂，Control组不做处理。每组按药物处理时间分亚组，各亚组分别为6只小鼠。CPT-11处理当天记为day0。继续养殖，每天监测小鼠体重变化情况，分别在day3，day7，day14，day28，day56，分别取其腹腔细胞，经抗体标记后，利用流式细胞术检测其数量和表型。其中小鼠腹腔巨噬细胞的表面标识分子为CD11b、F4/80和MHCⅡ，B细胞的表面标识分子为CD23和CD19。2.细胞实验：取小鼠腹腔细胞，种在玻璃底的dish（5×105cell/dish）中，在37℃培养箱中培养2小时至贴壁，吸弃未贴壁细胞，利用免疫荧光显微技术检测腹腔巨噬细胞的表面标识分子CD11b，F4

5、/80和胞内转录因子GATA6的表达情况。3.细胞过继移植：取同品系正常的小鼠腹腔细胞和骨髓细胞，分别过继到经腹腔注射CPT-11处理7天后的小鼠体内。过继后三周检测腹腔巨噬细胞和B细胞的数量和比例。4.细菌感染小鼠实验：小鼠分成3组，分别为Control组、Vehicle组和CPT-11组。Control组不进行任何处理，Vehicle组腹腔注射溶剂，CPT-11组腹腔注射200mg/kg的CPT-11悬浊液。7d后，把亚致死剂量（1×109CFU）大肠杆菌活菌悬液。每隔6h观察一次并且记录小鼠的生存情况，连续观察4天（总共观察96h）。5.组织化学观察：将小鼠处死后，取出大小肠立即用4%的

6、中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋切片后，用苏木精-伊红染色，用蔡司倒置显微镜，选择ZeissAxioObserverD镜头彩色CCD拍照获取图片。结果：1.小鼠腹腔注射CPT-11后，其腹腔巨噬细胞表型为CD11b+F4/80hiGATA6+的大腹腔巨噬细胞（LPMs）在一周内大量消失，但是14天后具有上述表型的细胞开始逐渐增加，说明该亚群细胞在自我恢复之中。然而，LPMs数量恢复的速度缓慢，停药后两个月（day56）LPMs的数量仅及Control或Vehicle对照小鼠II暨南大学硕士学位论文LPMs数量的一半，说明CPT-11腹腔注射对腹腔巨噬细胞有明显毒性作用，并且恢复过程漫长。2.CP

7、T-11腹腔给药后，腹腔内B1和B2细胞的数量明显下调。CPT-11处理3天后，小鼠体内B细胞比例占腹腔细胞总数的比例下降至3%。但是56天后小鼠腹腔细胞中B细胞在数量上几乎完全恢复正常。3.CPT-11腹腔注射处理一周后的小鼠进行同品系小鼠腹腔细胞和骨髓细胞过继移植。在上述细胞移植后21天，分析小鼠体内腹腔细胞的表型和细胞数量。结果显示，LPMs（CD11b+F4/80hiMHCⅡlow）的比例