利用酵母双杂交系统研究感病番茄品种中与Pto互作的基因

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1、中国农业科学院硕士学位论文利用酵母双杂交系统研究感病番茄品种中与Pto互作的基因姓名：洪玉梅申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：赵廷昌20060601摘要番茄细菌性斑点病是一种严重影响番茄质量和产量的世界性细菌病害。是由丁香假单胞杆菌番茄致病变种[愚8；dm∞∞缈魄雠pv-棚黝(okabe)Young，Dyc＆瑚Jkie】(PSl)引起的。番茄中的抗病基因JPr0与病原菌的无毒基因一v妒向互作是研究植物与病原物互作的典型模式系统。本文利用酵母双杂交系统，从感病番茄品种“中蔬四号”中筛选与，f。互作的基因。

2、我们实验室前期研究发现，感番茄细菌性斑点病的番茄品种“中蔬四号”中存在与尸fD完全一致的序列，为探讨感病品种有抗病基因而不抗病的原因进行了本试验。一方面能初步了解感病信号传导途径，另一方面也能了解植物—芮原物互作的机理，进一步阐明抗感病机制。本文(1)根据已知的蕃茄细菌性抗病基因，fD基因序列，台成了上下游引物，通过PcR扩增后，将获得的目的片段构建酵母诱饵表达载体pGBKT7．Pto，从而在酵母双杂交系统中表达诱饵融合蛋白。(2)合成了感细菌性斑点病番茄品种“中蔬四号”诱导表达的dscDNA，用以表达猎物文库的

3、融台蛋白。(3)将诱饵载体、dscDNA及猎物载体pGADrr7一Rec共转化到感受态的酵母细胞中，进行酵母双杂交筛选，初步筛选到与PIo互作的阳性克隆36个，根据测序结果将其分为i6类，有8类与植物中的相应基因序列同源性较高，另外8类在Genbank中没有找到与其同源的序列，为未知功能基因。对所测序列的结构域及oRF进行分析，发现在这些克隆中有含有wD40，Trallsmembrane，PhBp，RuBisco四类结构域；所测序列中5类含有ORF。(4)通过分析，没有发现在抗病品种中与Pto直接互作的Ph类蛋白

4、，另外有一阳性克隆45c，与其同源性较高的蛋白对Pto介导的抗病信号传导途径起抑制作用。推测这可能是感病品种中存在抗病基因而不起作用的原因。(5)建立了肋信号传导途径模型假说。关键词蕃茄细菌性斑点病，尸fo．中蔬四号，酵母双杂交第一章引言1．1番茄细菌性斑点病概述番茄细菌性斑点病．亦称番茄细菌性叶斑病或斑疹病，是由丁香假单胞杆菌番茄致病变种[舟P删锄彻a5印r，哪Ppv．f渊幻(0kabe)Young，Dye＆wilkie](简称PsT)引起的(赵廷昌等，2001)，能够危害番茄的叶、苹、花、叶柄和果实(赵廷昌等

5、，2001；时涛等，2003)。在番茄的苗期至收获期的整个生长季节造成危害，使番茄产量受到损失，在果实上的病斑还严重降低了番茄的商品价值。自1933年报道已来，已在美国、意大利、南非、澳大利亚等二十多个国家和地区发生．该病在15℃-25℃和80％以上的相对湿度下发病，可造成5％一75％的产量损失(YuⅡis，“口^1980)。在我国1998一1999年吉林省长春市番茄大棚内发现该病，现已漫延到黑龙江和辽宁省以及甘肃、山西、天津等地的番茄产区(刘秋等，．2002；时涛等，2003)，危害日益严重．因此如何经济有效的

6、防治这种病害的问题有待解决。目前选育与推广抗病品种是防治此病害蜃经济有效的措旋。PsT菌体短杆状，直或稍弯，单细胞，大小为1．5～4×o．1～l微米，革兰氏阴性，在含有蔗糖的培养基上能产生绿色荧光，菌株超过41℃则不能生长(赵廷昌，2001)。PsT存在着生理小种的分化，现已鉴定出PsT有两个生理小种．即生理小种0号和生理小种1号。RAPD和AFLP技术不能区分PsT的两个生理小种。病菌分血清学I和血清学II苗系。菌株的致病性、碳水化台物的利用、噬菌体敏感性和质粒情况具有多样性。菌株的总可溶性蛋白电泳图潜也存在很

7、大差异(se栅ein．“一．1996)。关于该病抗病信号传导途径的研究，目前主要是针对克隆的抗病基因及其下游的信号传导途径展开的(Ma九inGB，“越1999)。抗病基因Pro识别病原菌的无毒基因后，在其下游一系列的信号传导元件的参与卜产生抗病性反应。因此，对抗病基因的研究将会进一步明确抗病反应如何发生．进而能充分利用抗性资源，有效的防治该病。1．2番茄细菌性斑点病抗病信号传导途径的研究进展1．2．1番茄细菌性斑点病抗病基因尸亡D番茄抗细菌斑点病基因胁是从野生的番茄品种D唧P肛耙o"p呻抽P_I，}I台“l删中引

8、进到栽培品种中的．为单基因半显性遗传，位于第五条染色体上的s啊dwarf和m∞mcalvx之间(Pitablado，酣“1994)。番茄中的抗病基因Pf0与病原苗的无毒基因一w讹互作是研究植物与病原物互作的典型模式系统。1993年．Martin用图位克隆的方法克隆了番茄细菌性斑点病的抗性基因．P幻。肋基因是符合基因对基因学说而克隆的第一个植物抗病基因(M毗in．吖以199