酵母双杂交,报告基因

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1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划酵母双杂交,报告基因　　实验材料　　菌株　　酵母菌株AH109，带有四个报告基因，ADE2，HIS3，MELI和lacZ，在三个不同的GAL4上游激活序列和TATAbox的控制下ADE2和HIS3提供了营养选择标记，可以减少假阳性克隆的机率：MELI编码α-半乳糖苷酶，当底物X-α-Gal存在时，阳性克隆就会变成蓝色；lacZ编码β-半乳糖苷酶，当底物为X-Gal存在时，阳性克隆就会变成蓝色。该菌株具体特点见图3-1，3-2。　　图3

2、-1酵母菌株AH109的报告基因　　图3-2酵母菌株表现型　　质粒载体　　阳性对照质粒pGBKT7-53；　　阴性对照质粒pGBKT7-Lam；　　对照的AD质粒载体pGADT7-RecT均为clontech公司提供。　　HerringtestescarrierDNA购自invitrogen公司。　　载体信息见表3-1。　　表3-1本实验所用酵母双杂交载体信息　　培养基目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常

3、、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划　　⑴YPDA培养基　　Tryptone20g/L　　Yeastextract10g1L　　Adeninehemisulfute30mg/L　　Agar20g/L　　定容至950ml，PH=　　116℃高压灭菌15min，冷却至55℃时加入50m1过滤灭菌的40%的葡萄糖。　　⑵营养缺陷培养基　　YNB/L　　Agar20g/L　　根据不同的营养选择性培养基加入如下的dropoutSolution粉剂：　　SD/-Leu-Trp：在不含任何氨基酸的SD培养基中加入二缺粉剂/L。　　SD

4、/-His-Leu-Trp(三缺)：在不含任何氨基酸的SD培养基中加入三缺粉剂/L。　　SD/-His-Leu-Trp-Ade：在不含任何氨基酸的SD培养基中加入四缺　　粉剂/L　　定容到950ml，高压灭菌后加入灭菌的40%葡萄糖50ml，倒平板，于4℃保存。目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划　　主要试剂　　⑴1×TE/LiAc　　10×TE

5、1ml　　10×LiAc1ml　　ddH208ml　　合计10ml　　⑵1×PEG/LiAc　　50%PEG4000(polyethyleneglycol)8ml　　10×TE1ml　　10×LiAc1ml　　合计10ml　　⑶Zbuffer:　　Na2HPO4·7H2O/L　　NaH2PO4·/L　　KCl/L　　MgSO4·7H2O/L　　⑷X-galstocksolution：X-gal溶于DMF中，终浓度20mg/ml。　　⑸Zbuffer/X-galsolution：　　Zbuffer100ml　　β－ME　　X-galstockso

6、lution目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划　　实验原理　　实验原理见。　　实验方法　　酵母菌株AH109感受态细胞的制备　　⑴从-70℃冰箱是取出冻存的酵母菌株AH109，在YPDA培养基平板上划线，放入30℃的培养箱中倒置培养直至菌落直径长至2-3mm。　　⑵用接种环取新鲜的AH109单菌落1个，放入装有1ml液体YPDA培养基离心管中，

7、涡旋打散菌落。　　⑶将打散的菌液全部转入含50mIYPDA液体培养基的250m1的三角瓶中，30℃　　230rpm条件下摇大约18小时.检测OD600大于。　　⑷取浓度符合要求菌液大约25m1加入含300m1YPDA液体培养基的1000ml的三角瓶中，30℃230rpm继续摇大约3小时，使OD600在左右。⑸将摇好的菌液加入50ml灭菌离心管，在室温下，3000rpm离心10min。⑹弃上清，用10m1的无菌水重悬细胞沉淀。　　⑺室温下，3000rpm离心10min。　　⑻弃上清，用1m1的1×TE/LiAc重悬细胞，备用。　　酵母双杂交载体的

8、共转化　　pGBKT7-53和pGADT7-T共转化入AH109作为阳性对照。　　pGBKT7-lam和pGADT7-T共转化入AH109作为阴性对照