酵母双杂交protocol

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1、目录（一）介绍4（二）试剂盒物品清单7（三）额外附加物品列表9（四）酵母菌株11（五）酵母载体14（六）方法简述：单杂交文库的构建和筛选16方法简述：双杂交文库的构建和筛选17（七）构建用于酵母单杂交的报告质粒载体18（八）构建用于酵母双杂交的DNA-BD融合载体19（九）构建生成cDNA文库21（十）构建和筛选酵母单杂交和双杂交文库（简述）27（十一）酵母单杂交文库的构建和筛选28（十二）酵母双杂交文库的构建和筛选30方法A:通过酵母配对（YeastMating）来筛选目的蛋白30方法B:通过共转化的方法筛选目的蛋白35（十三）分析阳性相互作用结果38（十四）问题解决

2、指南44（十五）参考文献47（十六）相关产品50附录A:双链cDNA合成的典型结果51附录B:酵母感受态的制备—LiAc法52附录C：单杂交对照载体信息53附录D：双杂对照载体信息54表格列表TableI．BDMatchmaker酵母菌株的基因型11TableII．BDMatchmaker酵母菌株的表型11TableIII．单杂交系统的载体14TableIV．双杂交系统的载体15TableV．各BD-MatchmakerDNA-BD载体的比较19TableVI．RNA起始浓度和PCR扩增循环数之间的关系24TableVII．单杂交共转化的对照实验的设置29TableVI

3、II．单杂共转化对照实验：期望的结果29TableIX．双杂交转化的对照实验的设置33TableX．双杂交配对筛选的对照实验的设置TableXI．双杂交共转化的对照实验的设置TableXII．双杂交共转化的对照实验：期望的结果TableXIII．用于PCR筛选菌落的AssemblingMasterMixs54图片列表Figure1．使用BDMatchmaker单杂交系统筛选蛋白-DNA相互作用4Figure2．使用BDMatchmaker单杂交系统筛选蛋白-蛋白相互作用4Figure3．酵母单杂交和双杂交筛选的大致步骤5Figure4．构建和筛选BDMatchmaker

4、酵母单杂交和双杂交文库6Figure5．酵母菌株AH109和Y187中的报告基因12Figure6．BDMatchmaker酵母单杂交文库的构建和筛选16Figure7．BDMatchmaker酵母双杂交文库的构建和筛选17Figure8．用BDSMART技术合成高质量的dscDNA21Figure9．BDCHROMASPIN纯化柱和收集管26Figure10．通过酵母重整合作用来构建AD融合文库27Figure11．为双杂交筛选AD融合文库32Figure12．分析和证明可能的单杂交和双杂交相互作用阳性结果的策略39Figure13．通过酵母配对来验证蛋白-蛋白相互作

5、用42Figure14．用对照用人胎盘PolyA+RNA合成双链cDNA51Figure15．p53HIS对照载体的图谱53Figure16．pGAD-Rec2-53AD对照载体的图谱53Figure17．pGADT7-RecTAD对照载体的图谱54Figure18．pGBKT7-53DNA-BD对照载体图谱54Figure19．pGBKT7-LamDNA-BD对照载体图谱5554（一）介绍BDMatchmakerTMLibraryConstruction&Screening试剂盒提供一种简便的方法构建cDNA文库用来进行酵母双杂交和单杂交的筛选，这些试剂盒结合了BDM

6、atchmakerTMSystems和BDSMARTTMcDNASynthesis的技术，只需要用任何组织的1μgpolyA+RNA或totalRNA就能构建cDNA文库。通过一般细胞内克隆步骤，你能利用BDMatchmakerSystems所提供的灵敏的转录方法所构建的文库来进行单杂交或双杂交实验。单杂交实验的原理——蛋白-DNA相互作用实验单杂交实验使你能够确定和描述蛋白与目的顺式DNA激活序列的绑定，该序列可能是处于最小限度的启动子上游的用于增强转录的元件。这个实验也可以用于预测或新蛋白的DNA绑定结构域的确定。通过BDMatchmakerOne-HybridSy

7、stem你可以很容易的获得这些基因表达的蛋白在BDMatchmakerOne-Hybrid实验中，潜在的DNA绑定蛋白基因是与克隆在pGADT7-Rec2（为单杂交设计的低拷贝载体）上GAL4激活结构域（AD）序列一起融合表达的。一个或多个目的DNA序列的串联拷贝被构建在pHIS2（含有HIS3营养缺陷报告基因的报告载体）。DNA绑定蛋白和目标序列的相互作用会激活HIS3的转录（Figure1），该过程要在宿主菌株Y187（组氨酸缺陷型）中进行并在缺少组氨酸的培养基生长双杂交实验的原理——蛋白-蛋白相互作用的原理双杂实验分析能用于鉴定新的