猪牛杀菌通透性增加蛋白N端cDNA的克隆和原核表达

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1、摘要杀菌／通透性增强蛋白(bactericidal／pe珈eability—increasingprotein，BPI)是嗜中性粒细胞(polymorphonuclearneutrophils，PMNs)分泌的一种阳离子抗菌糖蛋白，具有选择性杀伤革兰氏阴性细菌(gram．negativebacterial，G一)和中和内毒素等功能。研究发现BPI的N端片段具有与BPI同等的功能。目前，BPI已被认为是极有发展前途的新一代高效杀菌、中和内毒素的药物蛋白。为探讨猪、牛BPIN端片段的功能、研制防治G‘感染的重组BPI生物制剂，本研究以长白猪和荷斯坦奶牛BPI为研究对象，运

2、用分子克隆技术，分别对两种动物BPI的N端eDNA进行克隆和原核表达。试验内容与结果如下：1印l氮端eDNA的克隆与序列分析采用密度梯度离心法，分离出猪、牛PMNs。应用TrizolReagent试剂盒从猪、牛嗜中性粒细胞抽提RNA。根据GenBank中已经登录的猪、牛BPIN端基因序列(猪：AF252874，牛：BCl02310)，设计合成两对引物(猪P1：￡GGAA—TT—CATGACTI'TGACCTGAGTGTGGAGGGC，P2：Q￡Q至￡Q△gTrACAGGCTGCTGCCGGACG：牛B1：￡Q鱼△笪皿gp汀GGCCAGAGGCCCTGAC，B2：鱼Q鱼

3、!Q鱼娜AAGGTGCCACCAGTGAGTAA)。在上游引物P1、B1的5’端设计了EcoRI酶切位点，在下游引物P2、B2的5’端设计了SalI酶切位点。运用反转录聚合酶链式反应(RT—PCR)技术，扩增获得了大小分别约为146bp和714bp的BPIN端片段。将纯化的扩增产物插入到克隆质粒pGEM．T-easy中，转化大肠杆菌DH5a，氨苄青霉素(—6山口)抗性筛选重组质粒。并将该阳性克隆质粒进行PCR鉴定和产物测序。PCR鉴定和产物测序结果说明重组质粒构建成功。测序结果显示：猪BPIN端eDNA序列与参考序列(AF252874)在第94位发生突变，牛BPIN端

4、eDNA序列与参考序列(BCl02310)在第503位发生突变；但氨基酸同源性均为100％。DNAstar软件对目的基因片段序列分析结果显示：猪BPI第2—146位与牛BPI第446--590位序列有81％的同源性，氨基酸序列的同源性达到了75％。2BPI氮端eDNA的原核表达纯化扩增产物与pGEX．4T-l质粒分别经EcoRI和SalI双酶切后，按3：1摩尔比进行连接，转化大肠杆菌肚2J，AMP抗性筛选重组质粒。PCR鉴定和双酶切结果显示重组表达载体PGEX-BPI，和PGEX-BPI。构建成功。PGEX-BPI，和PGEX-BPI。分别导入大肠杆菌BL21菌中，在

5、lmmol／L的IPTG诱导下高效表达。其中：猪融合蛋白分子量约为32kD(GST部分为26kD，BPIN端部分为6kD)：牛融合蛋白分子量约为52kD(GST部分为26kD，BPIN端部分为26kD)。经可溶性分析，重组的融合蛋白主要以包涵体的形式存在。包涵体经洗涤后，用十二IVAbstractBPI，alsoknown邪bactericidal／permeability-increasingprotein，isa55kDcationicantibacterialglycoproteinfoundinPMNs．BPIselectivelyexertsmultiple

6、anti-infectiveactivitiesagainstgram—negativebacteria，neutralizesgram-negativebacteriallipopolysaccharide(LPS)andSOon．ItwasfoundthattheN—terminalfragmentofBPIhaSidenticalactivitieswithfull—lengthofBPI．Presently,BPIisconsideredausanewpromisingantibacterialandLPSneutralizingdruginthefuture

7、．ThepigandthecoWwerechoosed嬲experimentanimals．ItWaSanaimtocloneandexpressporcineandbovinebactericidal／permeabilityincreasingproteinsN-terminalfragmentbymolecularclonetechnology．TheseexperimentalresultsprovidethescientifictheoryandfoundationforthefurtherstudyofbiologyfunctionofB