猪CD3ε、CD4和CD8α分子的cDNA克隆、序列分析与原核表达

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1、中国农业大学博士学位论文猪CD3ε、CD4和CD8α分子的cDNA克隆、序列分析与原核表达姓名：王建华申请学位级别：博士专业：预防兽医学指导教师：杨汉春20040601中囝农业大学博1学位论文摘婴摘要CD3、CD4汞ICD8分子是表达于哺乳动物T细胞和部分胸腺细胞表面的共受体与信号转导分子，它们共同参与TCR介导的T细胞活化和胸腺细胞分化过程。本研究应川RT-PCR和RACE技术从猪的外周血淋巴细胞和肭腺细胞总RNA中，分别扩增克隆了猪CD3e、CD4和cD8a分子的全KcDNA序列，对猪CD3e

2、、CD4和CD8a分子的cDNA序列及其推导氨基酸序列进行了分子信息学分析。采用融合蛋向原核表达策略，成功地在大肠杆菌中表达了猪CD3e、CD4和CDSa分子的胞外区肽段。1序列分析结果表明，猪CD3tcDNA序列长124Int。其中5。非翻译区80nt，3’非翻译区570nt，开放阅读框59Int，该开放阅读框编码196个氨基酸的猪cD3￡前体蛋白(无糖基化位点)。推导氨基酸序列的分析结果表明，在猪￡蛋白的胞外区Cys49、Cys91、Cysl”和Cys“1为保守性氨基酸残基；在猪CD3￡蛋自胞

3、浆区中，存在免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)、内质网潴留基序和SH3结合基序，这些基序与T细胞的活化信号转导和T(豫．CD3复合体装配相关，其中ITAM基序含有二个SH2结合基序和二个潜在酪氨酸磷酸化位点Tyr”和Tyr”。氨基酸序列比较结果表明，猪与人、鼠、狗、牛和绵羊CD3￡蛋白的氨基酸同源性分别为61．2％、58．7％、58．7％、65．1％和65．6％。2对猪CD4基因克隆和序列分析的结果表明，在猪的胸腺细胞和外周血淋巴细胞中存在两种方式剪接的CD4mRNA转录本，其中一种mRNA转录本

4、缺失编码40个氨基酸残基(包含跨膜区氨基酸)的120nt连续序列。推测该转录本编码猪分泌型CD4分子；猪CD4全长cDNA序列为2715nt，其中5q}翻译区158nt，3·非翻译区1183nt，开放阅读框1374nt，该开放阅读框编码457个氨基酸的猪CD4前体蛋白(含4个Ⅳ-糖基化位点)。推导氨基酸序列分析结果表明，在猪CD4分子中7个Cys残基(Cys43、Cys2、Cys”、Cys4”、cys421、(砷“和cys446)和2个Set残基(Ser432和Set4”)在哺乳动物种间保守；在猪

5、CD4分子胞浆区，存在高度保守的Src家族蛋白酪氨酸激酶p56“识别位点(KKTCQC)和内化相关双亮氨酸基序；氨基酸序列比较结果表明，猪与人、兔、鼠、狗和猫CD4蛋白的氨基酸同源性分别为56．0％、54．5％、44．9％、56．5％和56．9％。3序列分析结果表明，猪CD8a全长cDNA序列为2179nt，其中5’非翻译区165nt，3’非翻译区1303nt，开放阅读框71Int，该开放阅读框编码236个氨基酸的猪CD8ct前体蛋白(含1个M糖基化位点)。推导氨基酸序列的分析结果表明，在猪CD8

6、ct分子中．7个Cys残基(Cys”、Cvs”、Cysl”、Cys”、Cys“、Cys2”和Cys2”)在哺乳动物种间保守：在猪CDSa分子的胞浆区，存在Src家族蛋白酪氨酸激酶p56”识别序列CxCP。氨基酸序列比较结果表明，猪与人、牛、鼠、狗和猫CD8蛋白的氨基酸同源性分别为55．7％、57．6％、35．6％、56．8％和56．4％。4从重组质粒pGEM-TCD3A、pGEM-TCD4BIL和pGEM-TCD8B中。用PCR方法扩增扩增猪CD3e、CD4和CD8a分子的胞外区基因表达序列，分别

7、构建原核表达载体pGEX-4TCD3E、DGEX．6PCD4E和pGEX-6PCD8E，转化大肠杆菌BL21，在0．1mmoI／LIPTG诱导下表达。SDS．PAGE检测结果表明，猪CD3E、CD4和CDSa分子的胞外区肽段以融合蛋白形式在大肠杆菌BL21中表达．表达量分别占菌体总蛋白的20％、15％和20％。关键词CD3e；CD4；CD8a；克隆；序列分析中国农业大学博士学位论文AbstractAsCO—receptorandsignalmolecularexpressedonsurfaceof

8、Tcellsandthymocytesinmammalianspecies，CD3，CD4andCD8moleculesaleinvolvedintheactivationofperipheralTcellsandinthedifferentiationofthymocytes．Inthisstudytthefull—lengthcDNAsofporcineCD3e,CD4andCD80,．wereamplifiedandclonedfromtotalRNAofthelymphoc