DGGE分析婴儿肠道菌群多样性

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1、硕士研究生开题报告课题名称：人工与母乳喂养婴儿粪便微生物区系差异比较研究生：李晓敏指导教师：杨丽杰教授国内外研究进展早在20世纪80年代，就有很多对母乳喂养和人工喂养婴儿粪便微生物组成对比的研究。早期对肠道菌群的鉴定主要是采用传统的微生物分类和鉴定方法，依据微生物的形态学和生理生化等特性鉴定。有几个研究采用传统培养的方法研究表明无论是母乳喂养儿或人工喂养儿，最初定植的均是需氧菌，后是厌氧菌（Yoshioka，1983）。母乳喂养婴儿肠道的优势菌主要是双歧杆菌和乳酸菌，而人工喂养婴儿粪便中有更多的类杆菌属，梭状芽孢杆菌和肠杆菌(Balmer&Whar

2、ton,1989;Fuller,1991)。国内外研究进展婴儿粪便中双歧杆菌出现几率较大的是短双歧杆菌，青春双歧杆菌和长双歧杆菌，两歧双歧杆菌出现的几率较小，数量也少。有研究表明母乳喂养婴儿粪便中婴儿双歧杆菌是主要的，其次是长双歧杆菌和两歧双歧杆菌（MitsuokaT,1982；RasicJL,1983）。在一个欧洲的研究中指出短双歧杆菌是母乳喂养婴儿中的优势菌，人工喂养婴儿中长双歧杆菌和青春双歧杆菌常出现（MarcelisJH,1987）。类杆菌属主要是是吉氏拟杆菌，普通拟杆菌，脆弱类杆菌，人工喂养组的菌数比母乳喂养高，且数量差异较大；艰难梭状杆

3、菌在人工喂养组的定植率(49–66%)高于母乳喂养婴儿(6–20%)（MackieRI，1999）。国内外研究进展尽管大多数研究表明母乳与人工喂养婴儿粪便中微生物组成不同，但是也有很多研究表示他们之间存在的差异很小，特别是母乳喂养婴儿与人工喂养婴儿粪便中双歧杆菌没有太大的区别（Heavey,P.M,1999;Kleessen,B,1995）。这可能是婴儿配方奶粉改进的效果。另外还有的研究指出在这两组喂养中类杆菌属在厌氧菌中是优势菌，而双歧杆菌所占比例不及一半（B.LUNDEQUIST,1985），与其研究结果相一致的尚未发现。王小卉等(2004)对

4、采用荧光定量PCR技术研究了不同喂养方式对婴儿肠道菌群的影响，结果发现母乳喂养婴儿肠道乳酸杆菌、双歧杆菌数量较人工喂养婴儿高,而大肠杆菌数量较人工喂养婴儿低。PendersJ（2005）同样采取定量PCR技术检测了婴儿粪便中双歧杆菌，大肠杆菌和难辨梭状杆菌的数量，结果得出母乳喂养婴儿肠道微生物中的难辨梭状杆菌和大肠杆菌的数量和定植率明显低于人工喂养婴儿，而双歧杆菌在这两组中的定植率和数量大致相似。国内外研究进展目前应用于肠道菌群多样性研究的技术主要有16SrRNA序列分析、核酸杂交技术、PCR-SSCP、PCR-RFLP/T-RFLP、RAPD(随

5、机扩增DNA)、TGGE(温度梯度凝胶电泳)、DGGE(变性梯度凝胶电泳)等。其中DGGE技术是近几年国内外研究肠道菌群的主要技术之一。DGGE可应用于肠道微生物菌群多样性分析、肠道微生物菌群变化监测、肠道微生物分类鉴定等。随着分子生物学技术的发展，DGGE可以和一些分子生物技术如杂交技术、测序技术等结合起来(Muyzer,1993;Cocolin,2001),从而全面认识微生态的组成、优势菌群等。兰和魁等将DGGE与16SrDNA序列分析技术相结合，对DGGE图谱条带回收、克隆、测序，通过16SrDNAV6~V8区分析发现，喂养方式对早产新生儿菌

6、群的形成及演替有明显影响。M.R.MILLAR等（1996）采用16SrRNA-PCR-DGGE技术研究了研究患有坏死性小肠结肠炎和正常早产儿的粪便微生物。ChristineF等(2002)采用16SrDNA与PCR-DGGE技术结合的方法研究新生儿肠道微生物的演变.PrapaSONGJINDA等（2005）采用PCR-DGGE方法研究了新生儿肠道内菌群的动态变化。课题要解决（针对）的问题母乳与人工喂养婴儿粪便微生物区系是否存在差异及差异的大小仍存在一定的争议目前对人工和母乳喂养婴儿粪便中微生物区系中优势菌差异的认识还建立在传统培养方法上，这种方法

7、工作量大，而且所得到的结果受到培养方法的限制，无法对体系内的微生物进行全面的分析。课题的目的在16SrRNA序列分析的基础上，建立一种不依赖于分离培养的原位揭示不同喂养的婴儿肠道内优势菌群组成的分子生态学方法，同时也建立一种快速、简便的肠道菌群的分类鉴定系统。探讨人工与母乳喂养婴儿粪便优势菌的差异课题的意义为婴儿肠道微生物提供了新的信息，并为分析不同喂养方式对婴儿肠道微生物的影响；微生物对婴儿肠道性疾病的影响；改进配方乳优化婴儿肠道菌群；相关微生态制剂的开发和获得更好的经济效益等方面做一些基础工作。为今后与婴儿疾病相关的病原菌的分子检测技术的建立奠

8、定技术基础，对减少婴儿疾病的发生具有长远的意义。从肠道微生物的角度上分析了母乳喂养对婴儿健康的益处，为大力宣传母乳喂养，提