肠道菌群结构多样性初筛研究

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1、万方数据2010年5月第3期南京晓庄学院学报JOURNALOFNANJlNGX1AOZHUANGUNIVERSⅡYMav．2010No．3肠道菌群结构多样性初筛研究杜彩贺，周东蕊，肖飞，张仁敏，魏婷婷，胡芳(东南大学学习科学研究中心，江苏南京210096)摘要：目的：探讨研究肠道茵群结构的初筛方法，为进行有效、高质量的高通量测序奠定基础．方法：用粪便采样器采集健康儿童粪便进行粪便标本预处理后，采用酚一氯仿方法提取样本茵群基因组DNA，并进行16SrDNAv3区片段PCR扩增，扩增产物用变性梯度凝胶电泳法(denaturinggra—diemgeleleetr

2、ophoresis，DGGE)检测分析．结果：采用该方法成功地扩增出16SrDNAV3区230bp的片段，经DGGE的方法可以比较出不同儿童粪便样本茵群结构的不同．结论：基于16SrDNAV3区的PCR-DGGE技术能够应用于研究肠道微生物多样性，对于肠道微生物的研究起到了初筛的作用．关键词：16SrDNA；PCR；变性梯度凝胶电泳中图分类号：R574文献标识码：A文章编号：1009-7902(2010)03一0067—04宿主与肠道微生物的相互作用，会对宿主的营养、生理以及免疫产生严重的影响．目前，对宿主与肠道微生物之间相互作用的了解非常有限，对肠道微生物

3、是否会导致动物肠道紊乱等相关研究十分迫切．由于不完全了解这些生物体的培养条件，使得许多生物体的检测和鉴定在很大程度上受到阻碍．传统的微生物鉴别方法主要利用培养法或是形态学法进行细菌组成即细菌分类鉴定和菌群结构的研究，这些方法存在耗时长，特异性差，灵敏度低等问题¨j，最为主要的问题是多数细菌不能培养，能进行培养的细菌仅有1％一10％[2]．随着分子生物学技术的发展，尤其是细菌16SrDNA或rRNA技术的发展，肠道微生态的研究获得了新的进展．细菌16SrRNA的可变区序列因不同细菌而异，而恒定区序列基本保守，所以可以利用恒定区序列设计引物将16SrRNA片段扩

4、增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定p1．PCR—DGGE方法基于将16SrRNA的基因进行PCR扩增，得到长度相同的片段，然后在电泳中通过线性增加变性梯度分开不同序列的产物．其原理是基于16SrRNA基因序列的特异变性点溶化解链，各自单独的序列将在各自具特征的变性点开始溶解．那么部分解链的16SrRNA分子在凝胶中基本上停止了迁移，而完全螺旋形式的分子继续向前移动，这样不同的片段就被DGGE有效分离M1．然而，一旦变性剂浓度达到DNA片段最高的解链区域温度时，DNA片段会完全解链，成为单链DNA分子，此时它们又能在胶中继续迁移．

5、因此如果不同DNA片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来．在DNA片段的一端加入一段富含GC的DNA片段(GC夹子，一般30—50个碱基对)可以解决这个问题．含有GC夹子的DNA片段最高的解链区域在GC夹子这一段序列处，它的解链浓度很高，可以防止DNA片段在DGGE胶中完全解链．当加了GC夹子后，DNA片段中基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开bJ．它能够同时检测多个样品，可以对不同样品进行比较，利于细菌菌群多样性的动态观察的优势．因此，本研究利用PCR-DGGE方法对儿童粪便菌群结构进行研究，并参考有关文献对PCR—DGGE条件进

6、行了优化，建立收稿日期：2010—03—19修回日期：2010—04—21基金项目：国家自然科学基金(835911)作者简介：杜彩贺(1984～)，女，内蒙古赤峰人，东南大学学习科学研究中心硕士研究生，从事微生物研究．通讯作者：周东蕊(19r72～)，女，山东菏泽人，东南大学学习科学研究中心研究生导师，从事分子生物学研究，E—mail：jtmbail013@8叫．edu．衄一67—万方数据了研究儿童肠道菌群结构初筛的方法．1材料与方法1．1材料1．1．1粪便样品3位健康儿童提供新鲜粪便样品，标本1：男，5岁；样本2：男，l岁；标本3：女，6岁．1．1．2实验

7、仪器PCR仪(MJRESEARCHPTC-200PeltierTher-malCycler)；变性梯度凝胶电泳仪DCodeTMSystem(BioRad，U．S．A)．1．2方法1．2．1标本采集用粪便采样器采集健康志愿者粪便后于一20℃冰箱保存，在分析菌群结构前取出解冻．1．2．2粪便标本预处理参照文献【6]，略有改动．每份约2g粪便标本加入10IIll无菌PBS(0．05m01．L～，pH7．4)，充分振荡摇匀，5—10min，500rpm，离心5min，收集上清液，此步骤重复3次．8000rpm离心10min，弃上清，收集沉淀，将沉淀用1ml无菌水悬浮

8、，混匀．14000rpm离心5min，弃上清，收集沉