pcr-dgge法分析中华按蚊肠道菌群种类

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1、PCR-DGGE法分析中华按蚊肠道菌群种类（广东省食品药品职业技术学校，广东广州，510663）摘要：采用PCR-DGGE技术对中华按蚊成虫肠道细菌多样性进行研究，共检测到12条16SrRNA基因序列。在系统发育地位上主要归入3个细菌纲：丙型变形菌纲、黄杆菌纲和放线菌纲，其中有59.8%的细菌属于丙型变形菌纲，占绝对优势，成为中肠主要细菌群落。从而显示出中华按蚊成虫肠道细菌的复杂性和多样性关键词：中华按蚊，PCR-DGGE,肠道菌群，多样性中华按蚊是我国传播疟疾的主要媒介，是重要的医学昆虫之一。长期大量使用化学杀虫剂，导致蚊虫抗药性的出现和扩散、并严重污染环境⑴。因此，采用牛物防制

2、方法灭蚊引起了医学昆虫界及世界卫牛组织专家的广泛关注。Micks等（1961）曾报道按蚊肠道细菌密度减少与疟原虫密度增加的关系；抗牛素试验也表明减少按蚊中肠细菌将增加按蚊感染疟原虫的几率，按蚊肠道细菌群落结构变异影响疟原虫在按蚊肠道中的发育（Beieretal.,1994）0传统研究肠道菌群的方法存在极大的局限性，纯培养只能研究比较容易培养的微牛物［2］。目前肠道中能培养的细菌仅占肠道内总细菌数的10%-50%,随着分了牛物学技术的发展和相关研究的累计，逐步建立起来以微牛物基因组DNA序列信息为依据，通过分析样品中DNA分子的种类和数量来反映微生物之间、区系组成、群落结构以及微生物

3、与其周围环境条件相互作用关系的体系［4］。木文通过将PCR-DGGE法用于中华按蚊肠道细菌多样性的分析，鉴定其共牛细菌种类，分析其分子多态性。1、主要材料与仪器QIAampDNAStoolMiniKit（德国Qiagen公司）;细菌通用引物（Zhang&Jackson,2004）（上海捷瑞生物工程有限公司）;PCR扩增试剂（北京鼎国牛物技术公司）；40%丙烯酰胺；10%过硫酸镀（APS）；0%变性储备液（总体积100ml）：40%丙烯酰胺15ml,50×TAE缓冲液2ml,ddH2O83ml；100%变性储备液（总体积100ml）：40%丙烯酰胺15ml,50&

4、times;TAE缓冲液2ml,去离子甲酰胺40ml,尿素42g,ddH2O加到lOOmL台式冷冻离心机5417R（德国Eppendorf）;凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）；PTC-100型PCR仪（美国MJResearch公司）;基因突变检测仪（美国Bio-Rad）；水平电泳仪（北京六一仪器厂）；TH■系列梯度混合器（上海精密仪器仪表有限公司）;涡旋混匀器（美国fisherscientific公司）；台式离心机（德国Eppendorf）。2、实验方法2.1中华按蚊解剖选取刚羽化出来的未吸血的中华按蚊成虫35头，浸泡在75%的酒精中约10s,无菌操作下取出虫体并在无菌水中漂洗

5、10s,然后用尖头银子解剖肠道，将中肠放在装有1mlPBS缓冲液的灭菌的1.5mlEP管中研磨。2.2中华按蚊肠道微生物DNA的提取参照QIAampDNAStoolMiniKit试剂盒说明提取样品总DNA。2.3细菌16SrDNA片段的扩增将获得的肠道微生物总DNA用灭菌的双蒸水稀释10倍作为PCR扩增的DNA模板，利用细菌通用引物968GC-L1401进行PCR扩增。获得的PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。2.4细菌16SrDNA片段克隆将获得的中肠PCR产物连接到pMDIS-T载体上，转化到人肠杆菌感受态细胞中，通过在抗氨节的培养基中培养获得克隆子。2.5PCR产物的D

6、GGE分析从细菌克隆文库中随机挑取250个克隆子，通过提取质粒DNA获得PCR产物。将PCR产物在DcodeTM突变检测系统上，变性胶浓度范围30%—70%的变性梯度凝胶电泳中进行电泳分离。2.6测序将分离到的不同条带的克隆子挑取出来，培养12h,将菌液送北京三博远志生物技术有限责任公司测序。3、结果分析3.1DGGE结果经DGGE分析，成虫中肠250个克隆子中得到12种不同的遗传型，即成虫中肠至少有12种细菌。3.2序列分析将测序的结果在GeneBank数据库中用BLAST进行检索和同源性比较，成虫肠道分离岀的12条不同条带的基因片段序列与GeneBank中细菌序列相似性最高10

7、0%,最低为77%,其中7种细菌与已知序列相似性高于98%,可以认为是同一种(Devereux,1990；Fry,1991)。经过比对，中华按蚊成虫中肠细菌主要归入3个细菌纲，分别是丙型变形菌纲、黄杆菌纲和放线菌纲。3个纲的分布比例分别为59.8%,27.8%,12.4%。即在中华按蚊成虫肠道中大部分细菌属于丙型变形菌纲，是肠道的主要细菌群落。分离到的丙型变形菌纲的细菌有6株主要属于假单胞菌属、气单胞菌属和肠杆菌科的细菌，4、结论本实验利用变性梯度凝胶电泳技术从中华按