视网膜变性小鼠的基因治疗及其机制

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1、首都医科大学博士学r-H仑文视网膜变性小鼠的基因治疗及其机制中文摘要第一章猪眼虹膜色素上皮细胞的培养和其生物学评价目的:培养获得纯化的虹膜色素上皮(irispigmentepithelium,IPE)细胞，对体外培养IPE细胞的生物学特点进行观察，为以后的研究奠定基础。方法:采用Hu氏酶辅助的显微分离法分离新生猪眼IPE细胞，并置于含20%胎牛血清的F-12培养基中进行常规条件下IPE细胞的贴壁培养。倒置显微镜下对原代和传代培养细胞的生长情况进行观察。兔抗细胞角蛋白抗体(AEl/AE3)和兔抗S-100抗体对培养的IPE细胞进行免疫组化鉴定，并对IPE细胞的生物

2、学特征进行评价。结果:采用Hu氏酶辅助的显微分离法分离获得了单一的IPE细胞:经细胞角蛋白(AEl/AE3)和S-100抗体免疫组化染色均为阳性，无阴性染色细胞。IPE细胞培养成功率为85.0%。从IPE生长曲线上看，细胞于接种后二天开始进入细胞对数生长期，经过3-4天的对数期生长后进人生长缓慢的平台期。原代IPE细胞的贴壁率为31.8%士3.7%,细胞的活力为82.5%士5.1%，传代细胞的贴壁率为86.4%士4.3%，细胞的活力为91.2%士3.7%a。伸展率为83.6%士5.3%，倍增时间为2-7天，平均3.5士0.96天，总分裂次数为6-10次。结论:通

3、过酶辅助的显微分离方法，获得了WE细胞高效纯化的培养;高效纯化细胞培养体系的实现和有关IPE细胞生物学特征的数据为以后的相关实验提供了稳定的细胞来源和资料。首都医科大学博士学位论文第二章腺相关病毒介导碱性成纤维细胞生长因子基因对IPE细胞的转染及表达第一节腺相关病毒对IPE细胞的转染动力学和细胞毒性目的:研究腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)载体对IPE细胞的转染动力学和其细胞毒性，了解AAV载体转染IPE细胞合适的转染倍数(multipleofinfection,MOD、观察时间和转染效率，确定AAV载体在基因治疗中的可行性和安全

4、性。方法:酶辅助的显微分离方法培养IPE细胞并鉴定。应用AAV载体携带报告基因一绿色荧光蛋白基因(greenfluorescentprotein,GFP),按转染倍数为1护、1少、1护、10“转染已培养3天的传二代IPE细胞，转染后的第1,3,5,7,9天，在倒置荧光显微镜下观察IPE中GFP基因表达阳性的情况，记录100个细胞中GFP阳性所占的百分比。当GFP表达稳定后，共聚焦显微镜照相，流式细胞仪检测AAV-GFP对IPE的转染效率。唾磋蓝(MT)法检测不同病毒滴度的AAV-GFP载体对IPE细胞生长的影响。结果:AAV-GFP在细胞中的表达呈黄绿色，弥漫于

5、整个胞浆和胞核。MOI=103时，转染后48小时GFP开始表达，MOI=104,105,106时，转染后24小时便可看到GFP表达阳性的细胞，细胞的起始表达强度不一，随Mot值的增高而增强，同时GFP的表达强度随着时间延长而逐渐增强，转染后第7-9天达到高峰并维持，此时应用流式细胞仪检测AAV-GFP对IPE的转染效率，MOI=103时是26.7%,MOI=1了时是53.6%,M01=105时是60.2%,M01=10“时是63.7%.NM法显示:在不同病毒滴度的转染组，IPE细胞生长的OD值与未转染组比较无统计学差异。结论:AAV病毒载体对体外培养IPE细胞的

6、合适转染倍数在1了--1护之间，其转染效率可达60%以上。腺相关病毒对WE细胞生长无明显抑制作用，AAV作为视网膜色素变性基因治疗的载体是安全可行的。首都医和人学博士学位论文第二节腺相关病毒介导碱性成纤维细胞生长因子基因对IPE细胞的转染及表达目的:观察AAV载体介导碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)基因对体外培养IPE细胞转染后，bFGF基因在细胞内转录和翻译水平的表达。方法:取生长至90%融合的传一代IPE细胞，按常规细胞传代方法将细胞分种至25c时培养瓶，接种3天后，按MOI=105转染细胞，转染1周

7、后:(1)采用Trizol一步法提取IPE细胞的总RNA，设计特异引物，对bFGF基因在IPE细胞中mRNA的表达进行RT-PCR检测。(2)酶联免疫吸附(ELISA)方法检测转基因细胞培养液中的bFGF蛋白含量。同样条件下，不进行基因转染的细胞培养液和转染AAV-GFP的细胞培养液做对照进行统计学处理。(3)转基因IPE细胞表达的bFGF蛋白的生物活性检测:取传二代IPE细胞分别接种于%孔板和6孔板，常规细胞培养1天后，分别加人上述转基因组和对照组的细胞培养液，培养2天后，%孔板的细胞用于唾磋蓝(MT)法检测转基因IPE细胞表达的bFGF生物活性，6孔板的细胞

8、，酶消化后，流式细胞仪检