定量PCR实验设计和流程

《定量PCR实验设计和流程》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、Module2:定量PCR实验设计和流程Theworldleaderinservingscience1定量PCR的实验设计•准确定量样品的三个基本要求•定量PCR的实验要素•定量PCR的实验中的误差校正2准确定量样品的三个基本要求•重复性好•准确度高•动力学范围宽31.重复性:曲线一致性重复性好40个相同样本重复42.准确度与正确检测数据的接近程度53.动力学范围能得到高质量数据的线性范围(范围越大越好)6定量PCR的实验要素目的基因样品标准曲线标准品监控系统阳性对照监控污染阴性对照7目的基因:样品模板质量：纯度和浓度分光光度计检测：–DNA纯

2、度：OD/OD=1.8260280–RNA纯度：OD/OD=2.0260280Qubit®荧光定量：–分别定量DNA、RNA及蛋白质–准确性、灵敏度和简便性–Qubit®Assay(dsDNA,ssDNA,RNA,protein)8标准曲线:标准品目的：生成标准曲线，建立Ct值与浓度之间的线性关系要求：–绝对定量实验：标准品浓度已知–相对定量实验：标准品与待测样品的PCR效率一致，且接近100%•试剂质量一致：模板纯度、引物和探针的Tm值、酶活性、缓冲液成分•反应条件一致：循环参数相同9标准曲线:如何制备标准曲线•Don’t:•制备3个点的2倍标准

3、曲线•Do:•推荐制备至少5个点的10倍标准曲线(4logs)10标准曲线:标准品梯度稀释方法10倍连续梯度稀释方法：1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v不可由标准品i分别加不同体积的稀释缓冲液直接得到标准品ii、iii、iv、v11标准曲线:PCR扩增效率的确定E=10(-1/斜率)-1R20.99R20.99E=92.85%12监控系统:阳性对照100%能扩增出荧光信号的对照组正常实验中可当做阳

4、性对照的反应孔•标准品•内参(管家基因)13监控污染:阴性对照类型•无模板对照（NoTemplateControl，NTC）•无反转录酶对照（NoRTControl）•……通过扩增图谱、熔解曲线、电泳、测序等手段对阴性对照结果进行分析，以确认反应体系中是否存在污染14定量PCR的实验要素小结目标基因样品：模板质量标准曲线标准品：生成标准曲线，建立Ct值与浓度之间的线性关系监控系统阳性对照：标准品，内参(管家基因)监控污染阴性对照：无模板对照，无反转录酶对照15定量PCR的实验中的误差校正校准生物学误差内参(管家基因)校准物理误差参比荧光降

5、低随机误差重复实验16校准生物学误差:内参(管家基因)内参基因(EndogenousControl)用于校准实验过程中样品本身对定量结果的影响•原因：核酸提取时通常以重量，体积或细胞数为单位取样，提取过程中存在得率差异和操作误差，造成等量样品不一定获得等量提取物•目的：将定量结果校准为以基因组（或单个细胞）为单位，不同样品之间才具有可比性•校准方法：[目的基因]/[内参]=均一化的目的基因表达量17内参的选择在所有待测样品中，内参的表达量应当恒定不变常用内参基因，如18SrRNA、GAPDH等Human/Mouse/RatEndogenousCo

6、ntrolProductNamePartNumberTaqMan®ArrayHumanEndogenousControlPanel4367563TaqMan®ArrayMouseEndogenousControlPanel4378702TaqMan®ArrayRatEndogenousControlPanel437870418校准物理误差:参比荧光(ROX)MasterMix中ROX浓度固定ROX不参与PCR扩增，信号强度只与MasterMix用量有关ROX的功能：校准物理误差–耗材质量、管盖厚度、透光性能–反应体系监控：蒸发、操作Reporter

7、R=R/RReporternFAMROXROXRnRnROX19ROX校准增加数据精度20降低随机误差:重复实验生物学重复：样品三次重复技术重复：每个样品做3-4个复孔21定量PCR的实验中的误差校正小结生物学方面的误差：内参校正细胞数量的差异、抽提效率、纯化损失、反转录效率等物理方面的误差：ROX校正耗材质量（如管盖厚度、透光性能不一致）所导致的光学误差；反应体系监控（蒸发）。随机误差：统计校正重复实验，取平均值22定量PCR的实验流程3）选择化学方法1）样品采集2）选择提取方法探针法染料法6）验证实验扩增效率4）选择靶基因动力学范围5）购买

8、RT和PCR试剂自行设计准确度订购试剂盒精密度7）正式实验反应板设置8）数据分析