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时间:2020-07-27
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1、荧光定量PCR实验设计及优化pictureplaceholderPCR的建立与优化核酸纯化与逆转录PCR试剂体系引物、探针的设计23长度16-24bases(引物)序列不能有以下情况:任意2个引物或探针之间的序列互补引物或探针本身有二级结构连续的>GGG,引物的5’端有G引物3’端最后5个碱基有2个以上的G或C引物3’端最后1个碱基为AGC含量40-60%GCGC/AT分布大致均衡,C含量>G探针复性温度65-70°C引物复性温度60-65°CPCR引物与探针3标记淬灭基团采用无荧光背景的如BHQ,不要用tamraPCR
2、产物长度50-150bpDesignprimerdesignsoftware,选择序列保守区域如果保守区域太短,可以在引物中考虑引入LNA提高Tm探针可以考虑引入LNA或改用MGB或自淬灭taqman探针简并引物或探针需要同时考虑多种情况下的Tm高低纯化与否PAGE/HPLCPCR引物与探针4SNP的Taqman双色检测中,突变探针一般Fam标记相对定量分析中内参基因一般Hex标记(例如Roche的UPL相对定量解决方案)对检测要求更高的建议Fam标记(灵敏度或者定量vs定性)扩增效率较差的建议Fam标记PCR引物与探针5
3、ReactionConditionsPrimersandProbesConcentrationRange(finalcon.)Primers:0.1µM–1.0µMeachProbes:0.1µM–0.5µMStandardConcentrations(finalconc.)Primers:0.5µMeachProbes:0.2µMExample:UniversalProbeLibraryassayHigherprimers/probeconcentrationsgivebettersignaltonoiseratio(h
4、igherfluorescencesignalintensitiy)OnlyminorinfluenceonCpwhenusedinmediumconcentrationranges6PCR的建立与优化核酸纯化与逆转录PCR试剂体系引物、探针的设计7建立新的PCR体系:GeneralHints模板-DNA或cDNA为模板对照-NTC(notemplatecontrol)每个探针引物组合-阳性对照(如果可能)分析-扩增:sensitivityandefficiencyofPCR(crossingpoints)-熔解曲线分析(
5、SYBRGreenIformat):检测引物二聚体或其它非特异性扩增凝胶电泳:验证非特异性扩增meltingcurve(杂交探针等模式):突变检测或亚型分析8StandardConditionsinPCRMgCl2Concentration:2-5mM9BasicOptimizationinPCRUseanytemplatenucleicacid(NA)suitableforPCR,sufficientlypurifiedandfreeofPCRinhibitorsTemplateConcentration:建议测试多个稀
6、释度(最少2个梯度,10^2)genomicDNA50ng-5pgplasmidDNAapprox.106copiesRNA≤500ngtotalRNAor100ngmRNAcDNA≤50ngequivalentoftotalRNA,RTproductundiluted,1:10and1:100dilutionsNAStorageStorenucleicacidsinhighconcentrationsandaliquotsForlowtemplateconcentrations,usesiliconizedtubesan
7、daddcarrierNA(10ng/µl),e.g.MS2RNA10BasicOptimization:MgCl2TitrationMgCl2Titration:2-5mMFormat:SYBRGreenILCFastStartDNAMaster11BasicOptimization:TemplateConcentration模板浓度过高会抑制PCRTemplateDNAundilutedand1:10dilutionFormatSYBRGreenILIghtCycler®DNAMasterNTCsample1ori
8、ginalsample11:10sample2originalsample21:1012SYBRGreenIFormatPCRAnalysisExample模板拷贝数越低,越容易出现引物二聚体QuantificationMeltingCurveAnalysis13Optimization:Influen
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