粘虫细胞培养及苦皮藤素

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1、第34卷第11期西北农林科技大学学报(自然科学版)Vol.34No.112006年11月Jour.ofNorthwestSci2TechUniv.ofAgri.andFor.(Nat.Sci.Ed.)Nov.2006a粘虫细胞培养及苦皮藤素Ì,Í对其毒力的研究11211李君浩,祁志军,陈华保,钱勇,姬志勤(1西北农林科技大学农药研究所,陕西杨凌712100;2四川农业大学农学院,四川雅安625014)[摘要]以东方粘虫(MythimnaseparateWalker)为材料建立了新的昆虫细胞系,原代培养6个月后,胚胎细胞开始传代;用苦皮藤

2、素Ì和Í处理第3代传代细胞,24h后细胞裂解,出现大量细胞碎片,培养液变浑浊,其致死中质量浓度分别为76.42和129.34LgömL。粘虫背纵肌经胰蛋白酶部分消化后在Grace培养液中生长良好,培养2个月后有大量肌卫星细胞出现。[关键词]东方粘虫;细胞培养;苦皮藤素;细胞毒性[中图分类号]Q965[文献标识码]A[文章编号]167129387(2006)1120207205自德国人RichardBendict最早进行昆虫细胞0.2g,KCl0.2g,MgCl2·6H2O0.2g,NaHCO3的离体培养以来,目前已有500多株来自不同昆

3、虫0.15g,葡萄糖7.7g,双蒸水1000mL(122MPa下[122]及组织的细胞系得以建立。我国已经建立了20水蒸气灭菌20min),4℃冰箱保存备用。多株昆虫传代细胞系,并利用昆虫细胞杆状病毒表台盼蓝染色液:取1mL不完全培养基(未加血[3]达系统成功表达了40多种外源蛋白。昆虫细胞培清),加入10LL0.3%台盼蓝,4℃冰箱保存备用。养技术作为现代实验生物学极为重要的手段之一,1.2细胞培养方法[5]已广泛应用于医学、农业以及生物学的各个领域。刘1.2.1粘虫胚胎细胞培养参照Mitsuhashi和[4][6]惠霞等研究表明,新

4、型天然产物杀虫剂苦皮藤素Frerichs的方法并略有修改。取东方粘虫成虫新产Ì,Í作用于昆虫肌系统,中毒试虫肌细胞的质膜及的受精卵500粒,于28℃条件下培养24h,用体积分内膜系统发生明显病变。但有关离体条件下苦皮藤数0.2%NaClO消毒30min,再用体积分数75%酒素对昆虫细胞的相关研究尚未见报道。本研究以东精浸泡8min,然后用昆虫生理盐水洗3次。在操作方粘虫(MythimnaseparateWalker)为材料建立了台上用昆虫生理盐水漂洗,同时置筛网上用圆底试新的昆虫细胞系,并从细胞水平研究了苦皮藤素Ì管轻轻磨碎,少量培养液

5、冲洗,收集细胞,加5mL昆和Í对昆虫细胞的影响,以为从分子水平研究苦皮虫生理盐水,900römin离心8min,弃上清液。用培藤素Ì,Í在细胞上的作用部位及靶标提供依据。养基悬浮细胞,转培养瓶中于28℃条件下培养,每10d半量换液。1材料与方法[7]1.2.2粘虫肌细胞培养参照Marcia等和[8]1.1材料与试剂Baines等的方法并略有修改。取羽化第1天的粘1.1.1材料供试昆虫:东方粘虫6龄幼虫、成虫雌成虫,去翅与足,用体积分数75%乙醇消毒5~虫及卵,均由陕西杨凌西北农林科技大学农药研究10min,然后用毛笔去鳞毛、鳞片,固定于

6、蜡盘上,解所提供。供试药剂:苦皮藤素Ì和Í,纯度97%以上,剖镜下用单面刀片去前胸背板,暴露出中胸背纵肌由陕西杨凌西北农林科技大学农药研究所提供。培(鳞翅目成虫胸部最大的一块肌肉,由10束肌纤维养液:Grace培养液(Gibco公司)、胰蛋白酶组成)。在超净工作台上用刀片沿两翅基片内缘做纵(Genview公司)、台盼蓝(北京鼎国生物技术发展中向切割,除去头、腹部及背腹肌,即获得完整的背纵心Sigama公司分装)。肌。用Ranger液冲洗3~5遍,用眼科剪将肌肉束剪1.1.2试剂昆虫生理盐水:NaCl6.8g,CaCl2成1mm×1mm的

7、小块。在1000römin下离心10a[收稿日期]2005210226[基金项目]国家“973”项目“从天然生物源小分子发现农药新作用靶标、机制及先导结构”(2002AA245121)[作者简介]李君浩(1978-),男,河南洛阳人,在读硕士,主要从事农药毒理学研究。E2mail:junhao072@sina.com[通讯作者]姬志勤(1971-),男,山西永济人,讲师,主要从事天然产物农药研究。E2mail:jizhijun@163.com208西北农林科技大学学报(自然科学版)第34卷min,弃上清液。取质量分数0.25%胰蛋白酶3

8、mL白对照。将药液添加到接种有胚胎细胞的96孔板加入离心管,与组织块混匀,加上管口塞,消化15中,100LLö孔,培养24h后,在显微镜下观察细胞min,向试管中加7mL昆虫生理盐水,在1200中毒情况并拍

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