苦皮藤内生真菌hd3菌株的研究

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1、http://www.paper.edu.cn苦皮藤内生真菌Hd3菌株的研究112131杨春平，姬志勤，陈华保，钱勇，顾爱国，吴文君*1西北农林科技大学农药研究所，陕西杨凌712100；2四川农业大学农学院，四川雅安625014；3国家农药产品质量监督检验中心，南京210029摘要：从苦皮藤新鲜根韧皮部中分离得到的内生真菌Hd3菌株，初步鉴定为半知菌亚门，曲霉属(Aspergillus)环绕亚属(Subgen.Cirumdati)真菌。其菌丝体乙酸乙酯提取物对几种供试昆虫均有一定的生物活性。通过硅胶柱层析和反相半制备高效液相色谱切割分离，得到一个杀虫活性物质H4

2、.5，经波谱数据分析，将其结构鉴定为2,3-二甲氧基-5-甲基苯酚。关键词：苦皮藤;内生真菌;2,3-二甲氧基-5-甲基苯酚笔者通过对不同生态环境下的苦皮藤中的内生真菌进行广泛的筛选，得到一株编号为Hd3的产杀虫活性物质的内生真菌菌株，本文对其有效成分及其分类学地位进行了较为系统的研究。1材料与方法1.1材料1.1.1Hd3菌株从苦皮藤（采自陕西省杨凌区）新鲜根韧皮部中分离得到的内生真菌。1.1.2供试昆虫人工饲养的3龄粘虫(MythimnaseparataWalker)、3龄小菜蛾(Plutellaxylostella)和小麦蚜虫(主要种类为麦长管蚜Macro

3、siphumavenae)。1.1.3主要仪器恒温双层摇瓶机、制备型高效液相色谱仪、BrukenRPX300核磁共振仪1.2方法1.2.1发酵及提取Hd3菌株的液体培养：在250ml的三角瓶中装入100～125ml液体马铃薯液体培养基，封口，灭菌。待冷却后用接种针挑取少量菌落接种于培养瓶中，置于恒温摇床上，180～本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（20020712011）、国家863高技术研究发展计划（2002AA245121）资助[作者简介]：杨春平（1980－），女（汉族），四川人，在读博士研究生。＊[通讯作者]：吴文君（1945－），男（汉族），四

4、川洪雅人，教授，博士生导师，主要从事农药化学和农药毒理学研究。电话：029-870921911http://www.paper.edu.cn200r/min、26～30℃培养6～7d。Hd3菌株发酵产物的提取：发酵终止后用四层纱布过滤发酵产物，将菌丝体自然挥干后，组织捣碎机捣碎，石油醚回流提取3次，每次2h，用旋转蒸发器去除溶剂得到菌丝体石油醚粗提物。同法，分别用乙酸乙酯和甲醇溶液对菌丝体进行提取，得乙酸乙酯和甲醇粗提物。1.2.2杀虫活性测定（1）对粘虫和小菜蛾的活性测定触杀活性测定采用点滴法。用微量点滴器将1μL样品的丙酮溶液点滴试虫的前胸背板，观察试虫的中

5、毒反应。胃毒活性测定采用载毒叶碟定量饲喂法：挑选蜕皮一天以内的3龄粘虫幼虫，置于直经5cm的培养皿中，每皿1虫，饥饿8h。将供试样品以丙酮配成一定浓度的溶液，用微量毛细管点样器将1μL样品溶液均匀涂布0.5cm×0.5cm的小麦叶片上，即成为载毒叶片。每处理10头试虫，每虫饲喂一片载毒叶片。以丙酮点滴叶片作对照。记录试虫的症状表现并计算24h后的死亡率。（2）对小麦蚜虫的活性测定点滴法：同上。浸叶法：采集有一定数量（50头左右）蚜虫的小麦叶片，浸入样品丙酮溶液中并轻轻摇动5秒钟，取出后用吸水纸吸去多余药液。丙酮溶液作对照，重复4次。24h后检查结果。盆栽法：将样

6、品配成乳油，用清水稀释成一定浓度，对有蚜虫危害的盆栽小麦作喷雾处理，以不含样品但其它成分相同的乳油作为对照，每处理1盆，重复4次。分别于处理前和处理24h后调查活蚜虫数。1.2.3杀虫活性成分的分离先经硅胶柱层析，以不同的溶剂系统洗脱，通过杀虫活性追踪，分离有活性的馏分，然后再将活性高的馏分用反相半制备高效液相色谱切割分离，纯化有效成分。1.2.4杀虫活性成分的结构鉴定13主要依靠其核磁共振氢谱('HNMR)、碳谱(CNMR)及二维谱('H-'HCOSY)，并与相关文献对比，对分离得到的化合物进行结构鉴定。1.2.5Hd3菌株鉴定根据真菌的分类鉴定方法，通过观察

7、菌株菌落性状及菌丝、分生孢子、产孢结构等的形[1,2]态，对比相关分类系统，确定Hd3菌株的种属地位。2结果与分析2.1Hd3菌株菌丝体提取物对不同供试昆虫的杀虫活性2http://www.paper.edu.cnHd3菌株菌丝体提取物对3龄粘虫的杀虫活性测定结果见表1。由表1可知，只有乙酸乙酯提取物对3龄粘虫有很强的胃毒活性，48h死亡率达到100%。3种溶剂提取物对试虫的触杀作用都不明显。表1Hd3菌丝体不同溶剂提取物杀虫活性测定结果杀虫活性（%）样品胃毒触杀石油醚提取物00乙酸乙酯提取物100.0025.00甲醇提取物5.000注：样品为5%的粗提物丙酮溶

8、液Hd3菌丝体乙酸乙酯粗