疯草内生真菌——undifilum oxytropis合成苦马豆素的研究

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1、独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得宁夏大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：积劳砻时间：>bl≮年5月≥8日关于论文使用授权的说明本人完全了解宁夏大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阂，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学

2、位论文。同意宁夏大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：孤奄奄时间：2。lq年多月迎圈黜名：彳啦砖时间⋯竹对月谚日本研究由国家自然科学基金项目(31201962)提供资助TheworkissupportedbygrantformportedgrantIormlneNationalNaturalScienceFoundationofChina(31201962)苦马豆素甘油醛．3．磷酸脱氢酶内部转录间隔区线粒体核糖体小亚基棘豆弯曲芽管蠕孢菌a．甘露糖苷酶硝基苯基．

3、o．D．甘露糖苷改良基础盐聚乙二醇中英文缩写对照swainsonine，SWglyceraldehyde·3-phosphatedehydrogenase，gpdinternaltranscribedspace，ITSmitochondrialsmallsubunit，mtSSUUndifilumoxytropis，U．oxytropisa-mannosidasefi'omjaekbean4-nitrophenyl-a-D--mannopyranosidesubslrateMurashigeandskoogmajorsaltspolye

4、thyleneglycol，PEG摘要疯草是豆科棘豆属和黄芪属含有苦马豆素的有毒植物的统称，其主要毒性成分为苦马豆素(swainsonine，SW)，它是导致动物疯草中毒的根本原因。近年研究表明，疯草内普遍存在能产生SW的内生真菌——弯曲牙管蠕孢菌(Undifilumspp)，该类内生真菌是疯草中SW产生的主要因素，抑制或阻断内生真菌合成SW，将有望降低或消除疯草的毒性。目前，疯草内生真菌中的SW合成途径仍不清楚，研究各种因素对SW合成的影响可为进一步阐释疯草内生真菌中SW的生物合成途径和分子调控机制奠定基础。本文主要对疯草中产SW内生

5、真菌进行分离与鉴定，并研究不同因素对疯草内生真菌合成SW的影响，产SW内生真菌原生质体制备及再生，为进一步阐释疯草内生真菌中SW的生物合成途径、分子调控机制及疯草内生真菌突变菌株的选育奠定基础。1．从宁夏黄花棘豆中共分离到5株真菌，其中菌株NX．FEL001菌丝中含有苦马豆素，经诱导培养，该菌株能够产生分生孢子及分生孢子梗等结构，序列同源性和系统发育分析表明该菌株与Undifilumoxytropis真菌的亲缘关系最近，根据形态结构和分子进化分析结果将菌株r,rx．FEL001鉴定为Uoxytropis。2．研究不同pH、聚Z,---醇

6、(polyethyleneglycol，PEG)、L．哌可酸、L．赖氨酸、Q-酮戊二酸对Uoxytropis的生长和SW合成的影响。结果表明，当pH在4．5～6．s2．间时，pH对Uoxytropis的生长无显著影响，但在该范围内，较低的pH可抑制真菌SW的合成；PEG可促进Uoxytropis生长，但会抑制真菌SW的合成；L．哌可酸可显著促进U．oxytropis的生长，当其在培养基中的初始浓度为10。3mol／L和10五mol／L时，真菌中SW的合成受到抑制，当其浓度为10。4mol／L时，真菌中SW的合成显著增加：当培养基中L．赖

7、氨酸的初始浓度为10‘3mol／L时，U呸炒印西中SW的合成显著增加，而当，L．赖氨酸的初始浓度为10～mol／L、10。2mol／L或10。4mol／L时，真菌的SW合成受到显著抑制。当培养基中a．酮戊二酸的初始浓度分别为10～mol／L、10之mol／L、10。3mol／L时，Uoxytropis生长及SW合成的受到抑制；以上研究结果表明，L．哌可酸、L．赖氨酸、a．酮戊二酸可能是U．oxytropis合成SW的前体物质。3．悬菌液涂布于固体培养基上22℃培养15d，以1mol／L山梨醇配制1％纤维素酶+1％蜗牛酶+0．1％溶壁酶组

8、成的复合酶系，在菌丝与酶解液质量体积比为1：10，酶解温度为35℃，80r／min振荡酶解3h时的条件下，U．oxytropis原生质体的生成量最大。纯化后的原生质体在1mo儿山梨醇配制的YCM再生培养基上