构建带有突变的载脂蛋白CⅡ启动子的表达载体及体外表达研究

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1、山东大学碘士论文构建带有突变的载脂蛋白cⅡ启动子的表达载体及体外表达研究研究生陈春华导师曾英林教授专业分子免疫学中文摘要目的：檎建带有突变的载脂蛋白CII启动子的荧光素酶表达载体pG[．3，将其转染人宫颈缡细胞系Hela和人肝癌细胞系HepG2中瞬时表达，通过检测其荧光素酶活性，来拄讨载脂蛋白c】I启动子一190处的碱基突变与高脂ff『L症的发病机理之问的关Z列、：方法：1．构建带有突变的载脂蛋白cⅡ启动子的pGL3表达载体1．1定点诱变l，、插入有正常ApoCII启动子的质粒pG[，3为模板，设计一对

2、带有预期突变的完每q：补的引物；引物l：5GAATTCTCAGAGTGAGGGrTCCCl_GTCACTTGA4G3，引物2：5CTCAAGTGACAGGGAT℃CCTCACTCl"GAGAATTC3’，共34个馁基(带星号的为预期突变碱基)。反应体系50¨l，含10×反应缓冲液5u1，贞粒DNA模板10ng，引物1和引物2各125¨g，d3，fPmixture1ul(10m州一／1^PfuDNA聚合酶lul(2．5u／u1)；扩增条什：首先95。C预变性30S，然后95℃变性30S，55℃退火lmin

3、，68℃延伸12min，共12个循环。利用Stratagene的定点诱变试剂盒对ApoCIt启动子一190处的碱基进行突变，PCR扩增出带有缺刻的突变质粒。1．2酶切用限制性内切酶DpnI1ul(10u／p1)处理扩增产物，37。C水浴箱【=I_J消化亲本DNA模板1h。1．3转化山东大学碗_L论文将DpnI处理的扩增产物Iu1转化入XLI—B]Lie超感受态细胞中修复缺刻，进而筛选出阳性蕈组子进行DXA测序。2．突变的载熙蛋白cⅡ启动子在真核细胞中表达2．1脂质体转染使用Invitrogen公司的脂质

4、体转染系统，以pGL3一Basic为阴性对照，以pG[。3一control为Ⅲ性对照，剥崩pRLTK质粒作为内参照，与实验报告基因共转染入Ilela细胞和HepG2细胞；为使实验报告基因及内参照报告基因的基因表达相对独立，使内参照与各表达质粒的比值为l：25；分别将插入有jF常ApoCII启动子的pGL3质粒、构建的突变pGL3质粒、DGL38asic却pGL3一control质粒各0．4ug与16ng的pRLTK共转染入He]a细胞和HepG2细胞。2．2荧光素酶活性的测定利用_双荧光素酶测试系统，测

5、定突变昀和正常的载脂蛋自CII启动子的荧光素酶表达活性。转染48小时后，用细胞裂解液PLB裂解细胞；在与荧光测试仪配套的加样管中』』口入100ulLuciferaseAssayReagentII(I．ARII)，吸取20pl细胞裂解液上清与之混匀，尽快放入荧光测试仪，读取样品中pSL3携带的萤火虫荧光索酶激发底物所释放荧光的数值(数值M．)。读数完毕后，在同一力¨样管中加入100p1Stop＆G10“Reagent混匀，放入荧光测试仪中读取该样品中内参照质粒pRL一’涨携带的海肾荧光素酶激发底物所释放荧

6、光的数值(数值M：)。每⋯样品的数值M,／M。即为改质粒转染细胞所得的荧光素酶的相对活性。通过比较两者的表达活性来分析载脂蛋白CII启动子2190处的碱基由T突变为A对其调控活性的影响，进而从分予水平探讨高甘油三酯血症的发病机理。结果：1．定点诱变构建了带有预期突变的载脂蛋白c】I启动子的荧光素酶表达载体。插入有正常ApoCII启动了的质粒pGL3全长为5381bp。以整个质粒为模板，进行定点诱变，PCR扩增产物是带有缺刻疗勺突变质粒。在20gL一1琼脂糖凝胶电泳上显示相应的特异性条带即5381bp。扩

7、增产物经DpnI酶消化后，去除了正常的DNA模板链，雨转化入xI。1BLue超感受态细胞中修复缺刻。经jF、反向测序证明：只有载脂蛋白cII启动予190处的碱基由T突变为^。山东大学硕士论文2．瞬时转染和荧光素酶活性的测定将带有正常和突变ApoCIl启动子的荧光素酶表达载体分别转染He]a细胞和HepG2细胞；利用双荧光紊酶测试系统，分别测定细胞粗提液中萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性，以萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性的比值(M。／M。)来表示荧光素酶重组质粒的相对活性。结果表明：在Hela细胞和He

8、DG2细胞中，突变的ApoC1I启动子的荧光素酶表达活性比正常的ApoCII启动予的表达活性分别低17．94％$D18．56％。结论：载脂蛋白CII启动子一t90处的碱基由T突变为A不能消除重要转录因子在ApoCII启动子上的顺式作用元件的结合位点，只是部分影响ApoC】I启动子的转录活性。此位点的突变与高脂血症的发病机理有一定的关系。意义：对国内首例家族性ApoCII缺乏症的发病机理进行分子水平的研究；使我国划载脂蛋白病的研究接近国际先进