褐藻胶酶解寡糖的制备、分离和结构鉴定

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1、中国海洋大学硕士学位论文褐藻胶酶解寡糖的制备、分离和结构鉴定姓名：张真庆申请学位级别：硕士专业：生药学指导教师：管华诗2003.6.1酶解褐藻胶寡糖的制备、分离和结构鉴定摘要目的：本论文利用菌株Vibrio510产生的褐藻胶裂解酶降解褐藻胶，探讨酶解得到褐藻胶寡糖的生产工艺，及分离纯化褐藻胶寡糖以得到相应标准品从而丰富海洋寡糖库，以此为基本目的和出发点，并且为探讨该褐藻胶裂解酶酶解行为、酶解位点，做先期的工作。方法：应用紫外法与DNS法对该褐藻胶裂合酶的酶活进行测定。应用紫外扫描法、凝胶渗透色谱技术(HPGPc——TSKG2500PWxL)和聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PA

2、GE)对不同时间酶解产物组分的分子量及相对含量加以分析。对酶解寡糖进行分离纯化：应用凝胶过滤色谱法(Bio．GelP一4；P．6)、阴离子交换色谱法(Q。Sepharose．FastFlow)，其问应用新技术——快速液相色谱仪(FPLC)对分离条件进行优化和确定。对所得寡糖应用灌注色谱技术(HQ．20)检测其纯度。并应用此方法进一步纯化；同时运用荧光辅助糖电泳(FACE)和高效毛细管电泳(HPCE)技术作为进一步检测纯度的方法。应用ESI—MS、NMR等对得到的寡糖进行结构鉴定。结果：本文应用紫外法和DNS法对该酶的酶活进行检测，从海藻中筛选出的菌株Vibrio510

3、所产褐藻胶裂解酶有较高的比活力：22，5unit／mL。HPGPC和PAGE方法对褐藻胶的降解程度有良好的检测效果，快捷、高分辨率和直观是这两种方法的共同点。凝胶渗透色谱与阴离子交换色谱均对褐藻胶寡糖有良好的分离效果，得到四个组分。经灌注层析进一步纯化，应用FACE和HPCE检N-糖为一结构单一的化合物，三糖到五糖＼，、-———一～‘～——，“’—一均有异构体的存在。应用ESI．MS确证四个组分分别为二糖到五糖，且聚合度单、、_，‘、—··-——’，一一。同时对结构单一的二糖利用1H．NMR，”C—NMR，1H13CHMQC和1H-1HCOSY进行了结构的确定——非还

4、原端存在双键的古罗糖醛酸二糖。讨论：一方、、，～、—，—、—／，—'————一、、一．—／一面，通过进一步的分离纯化得到单一结构的化合物，在对单体结构进行分析确定的同时，所得结果将会为酶解行为特点的确定提供必要的信息，以便于对酶解工艺作进一步的指导：另一方面得到较高聚合度的寡糖，并进行活性的筛选。关键词：褐藻胶裂解酶寡糖分离纯化结构分析Preparation，IsolationandStructureelucidationofalginateoligomersdegradedbythealginateiyaseAbstractTlliSthesismainlyinvo

5、lvedtheproducingtechnicsandpreparationofalginateoligomersdegradedbyanalginatelyase．whichwasproducedbyastainV／brio510selectedfromalgae．asmarkers．Anotheraimofpreparationisenrichmentoflibraryofmarineoligosaccharides．Atthesametimeisolationpurificationandstructureconfirmingoftheseblocksisthe

6、firststageofdeterminationofactionpatternofthelyase．Thealginatelyasehashigherspecificactivityof22．5unit／mL．AnalysisofthedegreeofdegradationbyUVscan，HPGPCandPAGE，analysisofsamples’molecularandpercentofeveryfractionbyHPGPC，inwhichseriesTSKG3000PWxlandTSKG2500PWxI．wasapplied，arethefoundatio

7、nofproducingtechnicsofalginateoligomers．Isolationandpurificationofalgmmeoligomers：Gelfilterchromato脚hy(Bio—GelP-4，P-6)andanionexchangechromatography(Q—sepharoseFast．Flow)wereapplied，inwhichfastperformanceliquidcllromato鲈印hy(FPLC)wasappliedandtherearegoodresults．Fourblocks(dp：2-