胶质瘤特异性肽疫苗相关肽及胶质瘤特异性启动子的鉴定

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1、中国医科大学博士学位论文胶质瘤特异性肽疫苗相关肽及胶质瘤特异性启动子的鉴定姓名：吴安华申请学位级别：博士专业：细胞生物学指导教师：张学2003.4.1中文摘要目的多形胶质母细胞瘤(GBM)大约占所有已诊断脑肿瘤的三分之一。尽管应用各种治疗方法，包括手术切除，放疗和化疗，多形胶质母细胞瘤患者的预后仍极差，因此开发新的特异性的胶质瘤治疗方法成为当务之急。有临床应用前景的治疗方法包括基因疗法和免疫疗法。对于肿瘤相关抗原的克隆和分析，以及对于可被细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别的肽片段的鉴定，为肿瘤的免疫治疗提供了新的可能性。近年来，研究者在开发肿瘤的免疫治疗方法方面进行了大量的努力，

2、不论在体内还是在体外，均取得了令人鼓舞的结果。对于胶质瘤相关抗原如tenacin，gp240和EGFRvlII的克隆和鉴定，使有效的胶质瘤免疫治疗成为可能。EGFRxrIII突变存在于60—70％的多形胶质母细胞瘤和胶质肉瘤中。这种突变型受体不存在于任何正常组织中，这使它成为胶质瘤免疫治疗的适宜靶点。随着从骨髓或外周血单核细胞(PBMC)中分离和培养树突状细胞(DC)：疗法的发展，应用装载有肿瘤相关抗原的同源树突状细胞进行免疫已经成为一种非常有前途的肿瘤免疫治疗方法。在抗肿瘤实验中，DC可以装载肽(肽疫苗)，肿瘤碎片或重组蛋白质，其中，研究最广泛的是肽疫苗。研究显示，应用装载有

3、肽片段的DC进行免疫，可以产生针对多种人类肿瘤的肿瘤抗原特异性CTL。然而，开发肽疫苗的一个最主要的挑战就是鉴别可以用做肿瘤抗原特异性CTL靶点的肽片段。现在已确定的大多数肿瘤相关抗原的CTL结合肽均与HLAas0201基因型相关，这种基因型是世界上大多数种族中主要的HLA亚型。因此，鉴定受HLAa+0201限制的恶性胶质瘤抗原相关的CTL结合肽，将在恶性胶质瘤的免疫治疗方面起十分重要的作用。另外，HLAa。0201转基因鼠已经建立，并被用来确定来源于肿瘤相关抗原的人CTL肽的免疫原性。综上所述，基因型为HLAa*0201的恶性胶质瘤细胞系对于鉴定CTL相关肽，以及在体内和体外

4、评价恶性胶质瘤免疫治疗方法具有十分重要的意义。因此，在本研究中，我们的第一个目的是：通过PCR—SSP和自动测序法鉴定几种基因型为HLAa臻0201的恶住胶威瘤细胞系，并迸一步证实这些新鉴定的珏酞a冰0201胶凌瘸缀稳系是否莓以用予开发恶性狡璇癯豹免疫治疗方法。近年来，研究者已经鉴定了许多可被肿瘤特异性CTL识别的肽片段，但其中大多数都与黑色索瘤特异性抗原如：tyrosinase，tyrosinase相关蛋白1和2，gpl00，MAGE一1和MAGE～3等褶关。而起源子EG豫viii，受MHCl型分子(如羽盖a宰0201)限制的款片段尚没有被签定。嚣戴，本研究豹第二令鬟戆是：鉴

5、定受珏姒8母0201限定的胶质癀特异性抗愿EGFRvllI相关肽，势证实他们予体外诱导产生肿瘤特异性CTL的能力。在过去的十年中，研究者分离得到许多肿瘤组织特异性启动子和增强子序列，并将他们用予恶性肿瘤的基因治疗。一种可能鸯胶质癌特异豫窟囊子调控懿基嚣(1己一13Ra2)最近扶人学癌细胞系孛被竟隆出来。许多涯据显承lL—13Ro【2在大多数人恶性胶质瘸中赢表达。另外，IL一13Ra2基因在正常脑组织及人体其他正常器官中的表达微乎其微。人IL～13Ra2基因的这种特性使它成为蛋白质／肽为基础的疫菌或免疫毒素治疗的理想靶点。尽管lL一13Ra2是一种重要的受疫骥节分子翱肿瘤治疗的靶

6、分子，他在大多数胶覆瘸发生发展中所起的佟用仍不清楚，两且尚无人理解此基因表达的调节机制，对于调节此基因表达的顺式调节元件和反式作用因子的鉴定，将可以协助我们解释IL一13Rot2在人备种组织中的特殊表达方式，同时也可以使我们阐瞩此分子在免痰调节和嚣申瘤发生中的作用。嚣踅本研究懿第三令鬟的楚：竞隆入IL一13Ra2基因启动子，并确定对此定动子功能起决定作用的调节区域。恶性胶质瘤患者的不良预詹使IL一13Ra2基因相关疗法的研究显得尤为重要。Mouse和rat是恶性胶质瘤临床前期实验最常用的两种动物模墅。因此，我们应该了解与入IL一13Ra2基因褶似的l／lOUSe和rat体内的相

7、关基溺。Donaldson等酝经克隆了mouse的毯一13陇基嚣。隧越本研究的第四个是的是：克隆rat的IL一13Rce2基因并检测此基因在rat各种组织中的表达情况。·2·方法1．用PCR—SSP和自动测序法进行基因型鉴定PCR—SSP可以分辨HLAA2和菲HLAA2等位基因。HLAA2阳往标本的E'NA扩增片段应耀PCR缝化试剂盒纯化并送交AGAC(SaintPaul，MN)测序。根据HLAA2钋显予2；}援外显子3的共阉序歹l』设计测序弓l物。对于每一个HLA3_2DNA标本重复进行P