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时间:2018-11-11
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1、人脑胶质瘤特异抗原肽白介素【摘要】目的:构建白介素-13α2受体(IL-13Rα2)重组表达质粒,为检测IL-13Rα2抗原肽的表达奠定实验基础。方法:利用RT-PCR法从U251胶质瘤细胞株中获得IL-13Rα2目的基因,并与克隆质粒pMD19SimpleT载体连接转入DH5α菌克隆,用XhoI和HindIII将目的基因从克隆质粒上切下并与同样双酶切后的表达质粒pET-28a连接,转入BL21(DE3)菌,提取重组质粒进行酶切及测序鉴定。结果:目的基因IL-13Rα2与表达质粒pET-28a连接,成功构建pET-28a-IL-13Rα2重组质粒。结论:
2、IL-13Rα2目的基因能经RT-PCR法获得,并能成功与表达质粒连接,构建pET-28a-IL-13Rα2重组质粒,为今后检测IL-13Rα2抗原肽的表达以及利用其来免疫治疗胶质瘤提供了良好的实验基础及理论依据。【关键词】胶质瘤白细胞介素13受体质粒Abstract:Objective:ToconstructrebinantexpressionplasmidpET-28a-IL-13Rα2thatcontributetotheexpressionofIL-13Rα2antigen.Methods:ObtainTheobjectivegeneIL-13R
3、α2fromU251gliomacelllineidpMD19SimpleTvectorandtransfertoDH5α.DigesttheIL-13Rα2fromrebinantcloningplasmidusingXhoIandHindIII,thenconnecttotheexpressionplasmidpET-28athateenzymes,andconverttotheBL21(DE3).Atlast,extracttherebinantplasmidandidentifyitusingPCRdigestionandsequencing.R
4、esults:TherebinantexpressionplasmidpET-28a-IL-13Rα2U251gliomacelllineusingRT-PCRandconnecttotheexpressionplasmidpET-28asucceed.TheconstructionofpET-28a-IL-13Rα2hasagreatconctributionnotonlytotheexpressionofIL-13Rα2antigen,butalsototheimmunotherapyofglioma.Keya;IL-13;receptor;expr
5、essionplasmid近年来,随着对分子生物学及免疫治疗认识的不断提高,胶质瘤的免疫治疗不断得到重视,而IL-13Rα2作为脑胶质瘤的特异抗原肽,可由树突状细胞递呈抗原信息,激活细胞毒性T淋巴细胞来杀伤肿瘤细胞[1,2]。本研究旨在构建IL-13Rα2的表达质粒,为今后进一步检测IL-13Rα2抗原肽的表达及进行免疫治疗研究奠定实验基础。1材料和方法1.1主要试剂与细胞株Trizol试剂(购自美国Invitrogen公司),FermentasFirstStrandcDNASynthesisKit(购自MBI公司),U251胶质瘤细胞株(购自中科院上海
6、生物细胞研究所),DMEM高糖培养基(购自上海生工),ExTaq酶、HindⅢ内切酶、XhoI内切酶、T4DNALigase、X-Gal、IPTG、pMD19SimpleT载体、DH5α菌(均购自大连宝生物公司),胶回收试剂盒、质粒小抽试剂盒(购自BBI公司),pET-28a表达质粒(购自上海捷瑞公司),BL21菌为本实验室保存。1.2主要仪器细胞培养箱(HARRISUSA),超净工作台(TelstarBio-Ⅱ-A),倒置显微镜(LEiCADMIL),PCR仪(ThermoHgbaid),高速离心机(SaitexiangyiTDZ5-EM培养基(含10
7、%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素)的六孔培养板中,37℃、5%CO2条件下进行培养,3d传代一次。1.3.2RT-PCR获得IL-13Rα2目的基因:Trizol一步法从培养的胶质瘤细胞中提取总RNA,Fermentas逆转录初始链cDNA合成试剂盒反转录为cDNA,并以cDNA为模板,用ExTaq酶进行PCR扩增获得目的基因。PCR引物根据Genbank中IL-13Rα2全序列(ACCESSIONNM_000640)设计,引物为上游:5'-GGCCTCGAGATGGCTTTCGTTTGCTT-3',下游:5'-GCGAAGCTTT
8、CATGTATCACAGAAAAATTC-3'划线处分别为XhoI和HindII
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