人脑胶质瘤骨桥蛋白的表达

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1、人脑胶质瘤骨桥蛋白的表达【关键词】神经胶质瘤Expressionandsignificanceofosteopontininhumangliomas　　【Abstract】AIM:ToinvestigatetheexpressionofosteopontininhumangliomasasannormalbraincellsandgliomacellsmunohistochemicalstainingandRTPCRmethod.RESULTS:Osteopontinacellsbutannormalbraincells.CONCLUSION:Osteopontine

2、xpressioningliomaiscloselyrelatedtothemalignantdegreeofglioma.　　【Keya;osteopontin;immunohistochemistry　　【摘要】目的：探讨骨桥蛋白（OPN）在人脑胶质瘤中的作用、表达及其意义.方法：采用RTPCR及免疫组化染色方法检测脑胶质瘤组织和正常组织中骨桥蛋白.结果：骨桥蛋白在胶质瘤组织细胞中表达，而在正常脑组织细胞中无表达，而且OPN的表达浓度与胶质瘤恶性程度呈正相关.结论：人脑胶质瘤中OPN的表达与其恶性程度密切相关.　　【关键词】神经胶质瘤；骨桥蛋白；免疫组织化学　　0

3、引言　　人脑胶质瘤侵袭性生长是术后复发和临床疗效差的主要原因，过程涉及到细胞信号传导、细胞黏附、细胞迁移等多个环节.骨桥蛋白（osteopontin,OPN）是一种含有整合素结合序列GRGDS的分泌型磷酸化酸性糖蛋白，它对于OPN的黏附功能起重要作用.整合素是OPN的受体，OPN通过细胞黏附序列GRGDS识别整合素与细胞结合，刺激了细胞信号的传送途径，促进了细胞的黏附与迁移，促使了细胞向恶性发展〔1-3〕，我们采用免疫组化和RTPCR方法，探讨OPN在脑胶质瘤中的表达.　　1材料和方法　　1.1材料　　河南省人民医院200308/200502手术切除胶质瘤转移和正常脑

4、组织标本共36例.按ED生物技术公司.按操作说明进行各组的OPN免疫组化染色.简要步骤：30mL/L过氧化氢室温孵育，DH2O冲洗，PBS浸泡，100mL/L山羊血清封闭；滴加适当比例稀释的一抗工作液，PBS冲洗；滴加生物素标记二抗，PBS冲洗；滴加辣根过氧化物酶标记物，显色剂(DAB)显色.阳性对照用已知OPN表达阳性的组织切片，阴性对照用PBS代替一抗，以胞浆/胞膜内出现棕黄色或棕色颗粒为阳性细胞.　　1.2.2总RNA的提取和RTPCR①每0.1g组织中加入1mLTrizol，提取总RNA并按说明书操作.②逆转录反应：总RNA4μg,0.5g/Loligo(Dt

5、)1μL,加入一定量DPEC处理水,使总体积少于15μL，放70℃5min.将反应体系立即置冰上，再加入5mmol/LBuffer6μL,10mmol/LdNTP1μL,833.5μkat/LRNAsin0.5μL,3.334mkat/LMMLV1μL,用DPEC处理水定容于30μL.37℃1h,94℃5min.③PCR：将逆转录产物进行扩增.引物是自行设计并由上海生物有限公司合成.OPN上游引物序列为5＇CTGATGCTACAGACGAGGAC3＇(668687)；下游引物序列为5＇ACTATCAATCACATCGGAAT3＇（912893）；内参照G3PDH上游引

6、物序列为5＇GGTCGGAGTCAACGGATTGGTCG3＇(90113)；下游引物序列为5＇CCTCCGACGCCTGCTTCACCA3＇(877856).50μL的反应体系中加入10mmol/Lbuffer2μL,25mmol/LMgCl210mmol/LdNTP1μL,G3PDH引物各1μL,OPN引物各1μL,83.35μkat/LTaq酶0.5μL,反转录产物5μL,加DEPC处理水至50μL.94℃5min预变性，94℃30s→55℃1min→72℃80s,共30个循环，72℃10min,4℃冷却后-20℃保存.④电泳及定量分析：PCR产物行20g/L琼

7、脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果，凝胶成像系统分析灰度值，结果为OPN灰度值/G3PDH灰度值.　　统计学处理：各组织相对积分值以x±s表示，采用SPSS10.0统计软件进行数据处理，组间差异比较采用非参数秩和检验.　　2结果　　在正常脑组织中(Fig1)未见棕黄色或棕色阳性颗粒，即没有表达OPN，而在胶质瘤组织(Fig2)细胞膜和细胞质中以及血管内皮细胞均见棕黄色或棕色阳性颗粒，即表达OPN.且IV级胶质瘤组织中OPN的表达要比II级胶质瘤组织中表达明显增加（Tab1）.表1RTPCR检测OPNmRNA在正常人脑组织和人脑胶质瘤组织中的表达量（略）