人脑胶质瘤hif-1α和vegf表达分析

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1、查望墨型查兰堡主堂堕笙苎目前已发现的促血管生成因子包括纤维母细胞生长因子(FGF)，血管生长素(angiogenjn)，转化生长因子(TGF)，a一肿瘤坏死因子(TNF·a)，血管内皮细胞生长因子(vEGF)等，这些因子在促进血管生成方面往往具有协同作用。VEGF是现在已知的最强的促进新生血管形成的生长因子，参与许多生理及病理过程，可促进血管内皮细胞增生、迁移及增加血管通透性。在绝大多数脑肿瘤中均存在VEGF及其受体表达，说明VEGF与脑肿瘤血管形成关系密切。因此，阐明VEGF基因表达及其与脑胶质瘤的关系，对进一步认识脑胶质瘤的发生、发展及其诊断、治疗和预后有重要

2、意义。许多的研究结果还证实，转录因子缺氧诱导因子1．旺(Hypoxiainduciblefactor-lⅡ，HIF一1旺)在肿瘤的血管生成方面起到非常重要的作用。上述包括vEGF在内的多种促血管生成因子的表达均受到HIF．1q的调控。本实验的目的拟通过对不同病理级别的人胶质瘤标本中HⅢ．1a和VEGF的表达情况的检测，探讨HIF一10【与ⅦGF表达情况和胶质瘤恶性分级之间的关系，以及HIF．1a表达与vEGF表达的相关性，为胶质瘤的治疗提供新的方向。茎堡垦型查兰要圭堂垡笙兰(2)正常脑组织：4例正常脑组织均来自内减压手术，男性3例，女性1例平均年龄39．8岁。T曲

3、le1．1wHO(2000)class讯cationand伊adillgof37gliomas二、实验方法1．标本的收集与准备：以手术切除的胶质瘤标本或内减压术切除的正常脑组织标本，去除出血、外周坏死及电灼组织，用DEPC处理的生理盐水洗去血污。每份样本均分为三部分，一部分经10％福尔马林固定后进行常规病理学检查，一部分用OCT包埋，另一部分不作OCT包埋放入DEPc处理冻存管中，这两部分均立即浸泡于液氮速冻，随后于_80℃超低温冰箱保存，前者用于免疫组化，后者用于RNA核酸提取。2．R’r-PCR方法检测HIF．1q和vEGF的mRNA的表达：2．1总RNA的提

4、取：(按照天为时代总RNA提取试剂盒说明步骤提取总RNA)(1)组织：将组织在液氮中磨碎。每50～100mg组织加入1ml裂解液RZ，用匀9天津医科大学硕士学位论文浆仪进行匀浆。样品体积不超过裂解液Rz体积的lO％；细胞：按照10an2培养皿面积／1ml裂解液Rz加入裂解液，以下步骤同组织提取步骤。(2)将匀浆样品在室温放置5分钟，转入离心管，使核酸蛋白复合物充分分离。(3)加O．2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15秒，室温放置3分钟。(4)12000rpm离心lo分钟，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，水相的体积约为所用裂解液I

5、匕试剂的60％。把水相转移到新管中。(5)缓慢加入1倍体积70％乙醇，混匀。得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR。(6)10000×g离心30秒，弃掉收集管中的废液。(7)加O．5ml去蛋白缓冲液RD，10000xg离心30秒，弃废液。(8)加0．7删漂洗液Rw，10000×g离心30秒，弃废液。(9)加O．5m1漂洗液Rw，10000×g离心2分钟，弃废液。(10)将离心柱转入一个新的离心管中，加40“lRNase—ne水，室温放置2分钟，10000×g离心2分钟。．80℃超低温冰箱保存备用。2．2RNA浓度测定：吸取2山RNA样品，加水至800山混匀，转入石英比

6、色杯中，用紫外分光光度计(Uv-240型，岛滓)测OD值以检测所获mRNA纯度和浓度。OD260=1为40肛∥斗l。2．3RNA琼脂糖甲醛变性凝胶电泳：(1)制备1％琼脂糖凝胶，即将19琼脂糖倒入67mlDEPc处理水中，微波炉煮沸90秒至溶解，将10×MOPs电泳缓冲液10Inl、甲醛18Inl及EB5uJ加入上述琼脂糖溶液中，充分混匀后倒胶于电泳槽桥内，待胶冷却凝固后将电泳槽桥浸入电泳槽内，加入1×MOPs电泳缓冲液至没过胶面2mm，预电泳(5v／cIll)10分钟，待加样。(2)RNA变性，在每个印pondorf管内加入lO×MOPS电泳缓冲液2“l，甲醛4

7、“l，去离子甲酰胺10}ll，依RNA浓度每个eppondorf管内加入10¨gRNA，用DEPc水补足体系至20ul，于60℃温浴1小时后冰浴10分钟。10茎堡垦型查堂婴圭兰垡堡苎(3)加样，每个印pondorf管内加入2¨110×甲醛凝胶加样缓冲液，混匀，取5斗l样品点入电泳孔内，放置5分钟，电泳4小时(5wall)后于紫外线投射仪上观察条带，uvI凝胶成像系统拍照，存入计算机中。2．4cDNA第一链合成(逆转录)：逆转录试剂均购自大连宝生物工程有限公司，按照说明建立逆转录体系(表2．1)。Table2．1Re、rersetranscriptionsystel

8、nAAn，