脑胶质瘤特异抗原肽白介素-13α2受体重组表达质粒的构建.doc

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1、脑胶质瘤特异抗原肽白介素-13α2受体重组表达质粒的构建【摘要】目的:构建白介素-13α2受体(IL-13Rα2)重组表达质粒，为检测IL-13Rα2抗原肽的表达奠定实验基础。方法:利用RT-PCR法从U251胶质瘤细胞株中获得IL-13Rα2目的基因，并与克隆质粒pMD19SimpleT载体连接转入DH5α菌克隆，用XhoI和HindIII将目的基因从克隆质粒上切下并与同样双酶切后的表达质粒pET-28a连接，转入BL21(DE3)菌，提取重组质粒进行酶切及测序鉴定。结果:目的基因IL-13Rα2与表达质粒pET-28

2、a连接，成功构建pET-28a-IL-13Rα2重组质粒。结论:IL-13Rα2目的基因能经RT-PCR法获得，并能成功与表达质粒连接，构建pET-28a-IL-13Rα2重组质粒，为今后检测IL-13Rα2抗原肽的表达以及利用其来免疫治疗胶质瘤提供了良好的实验基础及理论依据。【关键词】胶质瘤白细胞介素13受体质粒Abstract:Objective:ToconstructrecombinantexpressionplasmidpET-28a-IL-13Rα2thatcontributetotheexpressionof

3、IL-13Rα2antigen.Methods:ObtainTheobjectivegeneIL-13Rα2fromU251gliomacelllinewasobtainedusingRT-PCR,thenconnecttothecloningplasmidpMD19SimpleTvectorandtransfertoDH5α.DigesttheIL-13Rα2fromrecombinantcloningplasmidusingXhoIandHindIII,thenconnecttotheexpressionplasmi

4、dpET-28athatwasdigestedusingthesameenzymes，andconverttotheBL21(DE3).Atlast,extracttherecombinantplasmidandidentifyitusingPCRdigestionandsequencing.Results:TherecombinantexpressionplasmidpET-28a-IL-13Rα2wasconstructedsuccessfully.Conclusion:TheobjectivegeneIL-13Rα

5、2canbeobtainedfromU251gliomacelllineusingRT-PCRandconnecttotheexpressionplasmidpET-28asucceed.TheconstructionofpET-28a-IL-13Rα2hasagreatconctributionnotonlytotheexpressionofIL-13Rα2antigen,butalsototheimmunotherapyofglioma.Keywords:glioma;IL-13;receptor;expressio

6、nplasmid近年来，随着对分子生物学及免疫治疗认识的不断提高，胶质瘤的免疫治疗不断得到重视，而IL-13Rα2作为脑胶质瘤的特异抗原肽，可由树突状细胞递呈抗原信息，激活细胞毒性T淋巴细胞来杀伤肿瘤细胞[1,2]。本研究旨在构建IL-13Rα2的表达质粒，为今后进一步检测IL-13Rα2抗原肽的表达及进行免疫治疗研究奠定实验基础。1材料和方法51.1主要试剂与细胞株Trizol试剂（购自美国Invitrogen公司），FermentasFirstStrandcDNASynthesisKit(购自MBI公司)，U251胶

7、质瘤细胞株（购自中科院上海生物细胞研究所)，DMEM高糖培养基（购自上海生工），ExTaq酶、HindⅢ内切酶、XhoI内切酶、T4DNALigase、X-Gal、IPTG、pMD19SimpleT载体、DH5α菌（均购自大连宝生物公司），胶回收试剂盒、质粒小抽试剂盒（购自BBI公司），pET-28a表达质粒（购自上海捷瑞公司），BL21菌为本实验室保存。1.2主要仪器细胞培养箱（HARRISUSA），超净工作台（TelstarBio-Ⅱ-A），倒置显微镜（LEICADMIL），PCR仪（ThermoHgbaid），高速

8、离心机（SaitexiangyiTDZ5-WS），全温振荡器（HZQ-FX），凝胶成像仪（BioSensSC620），HHS型电热恒温水浴锅，DU800NucleicAcid/ProteinAnalyzer。1.3方法1.3.1U251胶质瘤细胞培养：将胶质瘤细胞接种于含高糖DMEM培养基（含10%胎牛血清、100U