Flk1间充质干细胞分化机制研究

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1、北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文中文摘要干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，是研究细胞生物学基础科学问题的理想细胞模型。早期胚胎来源的全能干细胞具有无限扩增和分化为多种类细胞的能力。成体组织来源的多能干细胞也具有远比人们开始预料的大的多的分化潜能。本实验室从成人和胎儿的多种组织中均成功分离获得具有三胚层分化潜能的Flk—l+CD31一CD34一的间充质干细胞，其在体外具有很强的克隆形成和扩增能力，因此很可能成为组织工程中理想的种子细胞，用于治疗组织损伤和一些遗传及退行性疾病。以microRNA为代表的非编码小RNA领域是目前

2、的国际研究热点，越来越多的研究结果表明，小RNA广泛参与生物体各种生物学过程，包括细胞的增殖、分化、凋亡、肿瘤形成和生物体发育等。本研究的第一部分旨在研究tbRNA在间充质干细胞向造血细胞分化过程中所扮演的角色，寻找Flk-1+CD31。CD34一骨髓间充质干细胞(bMSCs)向造血分化过程中具有决定意义的小RNA，并研究其作用机制。首先根据人基因组序列，应用计算机软件预测筛选了500条待验证的小RNA，定$1]d,RNA芯片，检测并获得了人Flk-1+CD31‘CD34一bMSCs和人CDl33+造血干细胞(HSCs)的d、RNA差异表达谱；3种小RNA在bM

3、SCs中的表达显著低于HSCs中的表达：定量RT—PCR实验证实了芯片结果；小RNA克隆测序证实dxRNAZK-249为真实存在于人细胞中的内源性t]xRNA：利用逆转录病毒载体，上调ZK一249在bMSCs中的表达；免疫组织化学实验表明高表达ZK-249的bMSCs群体中，有少量CD45+造血细胞的存在；将细胞种植NCFUMIX中，表明这些细胞具有造血克隆形成能力；将shR-337高表达的人bMSCs从尾静脉注射到亚致死量照射的NODSCID鼠体内，检测人源细胞在小鼠骨髓中向造血细胞分化能力，组织化学和流式细胞术检测人源细胞表面CDl3、CD3、CD45、CD

4、34、CD71和CDl9等造血标志抗原的表达情况，结果显示，shR337能够促进bMSCs向淋巴细胞和粒细胞的分化；定量PCR检测结果表明ZK-249高表达的bMSCs中，造血相关转录因子RUNXl的表达显著增加；计算机软件预测表明EIDI可能是2北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文shR-337的靶基因，一系列验证实验，包括应用RNA干扰技术进行的功能验证实验，都证实了预测的结果。综上，d、RNAZK-249通过调节靶基因EIDl的表达，促进了Flk-1+C031一CD34一bMSCs向造血细胞的分化。本研究的第二部分研究成人脂肪来源的Flk一1+c

5、D31．CD34。间充质干细胞(AMSC)向上皮、内皮和神经细胞体外定向诱导分化后，mRNA和d,RNA表达谱的变化，从而从d、RNA水平及基因水平揭示AMSC自我更新及分化机制。研究结果提示，在基因水平上，TGFB和Wnt信号通路参与了AMSC“干性”的维持，而Notch和BMP4信号的激活则会促进AMSC的分化。在小RNA水平上，尽管目前对于d、RNA的功能的了解还非常有限，还是根据芯片的检测结果，归纳总结了可能和AMSC“干性"相关以及与AMSC向上皮、神经和内皮细胞定向分化相关的小RNA，并对小RNA的调控机制作了初步推测。另外对AMSC细胞中小RNA的

6、克隆测序从另外一个角度获得了AMSC的d、RNA表达谱，对测序获得的d、RNA与已鉴定的microRNA数据库及我们的预测小RNA数据库进行比对，结果表明，对于已知的microRNA而言，克隆测序结果中所显示的高拷贝往往对应着芯片检测结果中的高信号值，说明这两种检测方法获得的结果是平行可信的；另外还获得了21种目前没有报道的小RNA，其中一些与之前的预测结果结果相符，芯片结果显示的这些新的d,RNA在AMSC分化前后的变化，为d、RNA的功能研究作了初步提示。关键词Flk-1+CD31一CD34一间充质干细胞小RNA诱导分化造血芯片检测d、RNA克隆测序3北京协

7、和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文AbstractStemcellresearchisoneofthemostfascinatingareasofbiologytoday．Inourlab，Flk．1+CD31。CD34。MSCscouldbeisolatedandpurifiedfromvariousfetaloradulttissues，whichhavebeenprovenwithextensiveclone—formingandexpansioncapacityandthepotentialtodifferentiateintocellsofall

8、threelayers，