骨髓间充质干细胞成肌诱导分化策略及其分化机制的分析

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1、第三军医大学博士学位论文骨髓问充质千细胞成肌诱导分化簧略及其分化机制的研究摘要骨骼肌占全身体重的40．45％。由肌细胞与神经、赢管组成，是机体重要的运动嚣室之一。各秘钊像热霉疆费、捻磐臻、烧嫠及帮傍癌科疾癍麴糖尿瘸、耱瘥翻瘫痪所致的肢体坏疽都常伴肌组织损伤。正常肌肉再生主要眭l肌卫星细胞(satellitecell，SC)完成，握SC数量少，旦薅年龄增长嚣下降。簿予严霆或嚣积较太数腿授佼，SC不足以达到修复瞄的，创面最终被纤维结缔组织替代而澎成瘢瘸，导致雉愈性创伤，搜撬传运动失能势影豌享枣经、盘罄系统。铡惩缎织工程技术，将透宣秽予纲您鬻罄在W选生物材料上植入肌损伤部位，促进肌损伤早期修

2、复最目前肌修复研究中的热点课鼹。有学等将sC接秽到聚羟基忍黢(polyglycolicacid。PGA)土攘入动物菝腔大阚膜中，发现30—40d后可形成含血管的功能性肌缎织，但SC采集中的有例性、难获得憷及含爨少豹缺陷铡约了其作为莘孛子缨髓的应用。骨髓闽充质予缨骢(mesenchymalstemcells，MSCs)具有向骨髓麓质细胞、成骨细胞、成软骨细胞、成脂细胞、成肌缨您及张经细胞在内的多种缨骢分化的潜能，来源丰富，易于分离和培菸，在体外可高度扩增。1995年，Wakitani酋先利用5．氮杂胞萤(5．azacytidine，5．Aza．CR)诱导MSCs分化为戏舰细胞，为MSCs

3、应用于肌分化研究打下了基础，但MSCs威肌分化的其体机制却来觅报道。肌细胞的分化成熟受生肌调带因子(myogenicregulatoryfactors，MRFs)调控，这怒一类称为成肌碱性螺旒。环．螺旋的转录因子[myogenicbasichelix．100p．helix(bHLH)transcriptionfactors]，目前发现有Myf5、MyoD、myogenin和MRF4四种因子。MRFs窳族基因在非虢细胞中辩位表达时，可激活被表这细胞淘成肌纲胞分纯，因此，推测5-Aza-CR诱导MSCs成肌分化时，MRFs相关纂因的诱搏表达W能是其分化的莉提。干绷胞的分纯过程怒缩胞感应步}

4、源刺激信号，实现倍号的跨膜转导的过程。了解信号转导途径对于进一步阐明基因调控机制，通过促进信号转导通路来促进干细胞定向分纯裔着重要意义。篓裂素活亿蛋岛激酶(mitogen-acfivatedproteinkinase，MAPK)是信号从细胞表面转导到细胞内部的重要传递者，包括细胞外调节蛋白(extracellularregulatedproteinkinase，ERK)、昏Jun氨蕊沫端激瓣(e-JunN．terminalkinase，j套醚)、应激第三军医大学博士学位论文活化蛋白激酶p38(stress—activaedproteinkinasep38)及ERK5，该信号转导家族在细

5、胞生长、应激和细胞间功能同步等多方面具有重要作用。在SC成熟分化过程中，磷酯酰肌醇-3(羟基)激酶(phosphatidylinositol3-OHkinase，P13K)的激活可启动其下游转录子Akt，促进sc的成肌分化。胰岛素样生长因子．I(insulin．1ikegrowthfactor,IGF．I)可以明显增强SC成肌分化的信号转导，促进肌分化，而在MSCs成肌分化中的作用尚无报道。若对比分析MSCs与SC成肌分化之间的调控差别，将从理论上深入阐明MSCs成肌分化的相关机理，在实践上更好将MSCs应用于肌损伤修复。SC正常时处于静止状态，在相关应激如创伤情况下被激活，表达MRF

6、s而定向成肌分化。当SC受刺激后约3-12h，SC即开始表达MyoD／Myf5。但什么是诱导SC表达成肌分化调控因子的直接因素尚未可知。肌损伤伤口液中丰富的细胞因子和生长因子可能是潜在的诱导因子，但迄今尚不能肯定这些因子具有诱导SC成肌分化的作用，仅发现它们具有促进或抑制SC增殖和分化的功能。有学者将单纯的MSCs和经5-Aza．cR诱导后的MSCs植入损伤后的心肌处，发现可明显促进心肌再生，增强心室心肌收缩能力，尤其经5．Aza-CR诱导后的MSCs组效果显著，但对创面中的局部因素对MSCs成肌分化的影响却未见分析。本研究以MSCs成肌分化的基因调控及信号转导等分子机制为出发点，通过

7、与SC成肌分化的过程比较，证实MSCs定向肌分化的相关机理；同时通过不同类型MSCs的移植，观察其在肌损伤部位的分化情况，探讨MSCs用于肌损伤修复的有效途径。主要实验方法及结果如下：一、骨髓间充质干细胞成肌诱导分化策略的研究：1、浓度的选定：分别选用0、1、3、5、10、20(umoVL)浓度的5-Aza-CR作用于MSCs，以MTT法分析不同浓度5．Aza．CR作用后，Balb／C小鼠MSCs的增殖情况，发现以5umol／L、10umol／