flk-1_272b_间充质干细胞分化机制研究

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1、北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文(GibeoBRL公司)；p．巯基乙醇(13-mercaptoethanohMerck公司)；碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblasticgrowthfactor,bFGF；Sigma公司)；内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF；Sigma公司)；表皮细胞生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF；Gibeo公司)；gltd,板衍生生长因子(platelet-derivedgrowthfactorBB，P

2、DGF—BB：Sigma公司)；胰岛素一转铁蛋白一亚硒酸(Insulin．Transferrin．SeleniuIIl，ITS；Sigma公司)；亚油酸．牛血清白蛋白(1inoleicacid．bovineserumalbumin，LA．BSA；Sigma公司)；氢化可的松(hydrocortisone；Sigma)；皂素(saponin；Sigma公司)；碘化丙锭(PI：Sigma公司)；流式抗体：CD29、CD3l、CD34、CD44、CD45、CDl05、Flk．1、CDl84、CD71、CD3、CDl9、CDl3、HLAcla

3、ssI和HLA．DR(均购自BDBioscience公司)；蛇毒毒素(cardiotoxm，CTXl；Sigma公司)；免疫组化试剂(福州迈新生物技术开发公司)；Western检测抗体：兔抗人EIDl单克隆抗体(购I刍Upstate公司)；免疫荧光试剂：兔抗山羊IgG．fluoresceinisothyocyanate(FITC)和大鼠抗小鼠IgG．TRITC(均购自SantaCruz公司)；CDl33+磁珠分选试剂盒、细胞分选专用磁力架、细胞分选柱(均购自MACS公司)；小IⅢA分离纯化试剂盒：miRNAIsolationKit(购

4、ElAmbion公司)；5’【y．32P】探针标记试剂盒(购自TAKARA公司)：【y．32P】ATP(购自北京福瑞公司)；RNA力H尾酶、RNAT4连接酶(均购买自TAKARA公司)：CFUMⅨ半固体培养基(购自StemCell公司)：小I斟A芯片定制委托北京博奥公司完成。二实验仪器l、37"(2恒温、5％C02细胞培养箱(TherrnaForma)2、无菌操作台(北京半导体设备～厂)3、25cm2、75cm2细胞培养瓶(Coming公司)、6孔板、24孔板、96孔板(美国costal"公司)4、常温台式离心机(德I虱Heraeus

5、sepatech)，低温台式离心机(美I垂ISigma公司3k20型，德国Hemeus公司Labofuge450R型)5、WH．2微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)7北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文6、倒置显微镜(日本Olympus公司)7、倒置荧光显微镜及照相系统(日本Nikon公司)8、分析天平(美国METTLER公司AE200型)9、电动移液器(德国ACCU．JET公司)10、电热恒温干燥箱(湖南长沙医用仪器厂)1l、流式细胞仪(美国Coulter公司FACSVantage型)12、GeneAmpPCRSyste

6、m2400PCR扩增仪(购自美国PE公司)13、DU．70型紫外分光光度计(购自美国Beckman公司)14、正置荧光显微镜及照相系统(日本Olympus公司)三、实验方法lCDl33+造血干细胞分离脐带血由北京脐血库惠赠，遵循知情同意原则。分离方法参照CDl33+CellIsolationKit(Miltenyi)提供的操作步骤，稍作修改，简述如下：200ml脐血，分装至4个50ml离心管，2000转离心10min(不带刹车)，弃上层一半血清，把中间含白细胞层部分转移至新的血浆瓶中，加入等体积BufferI(PBS含2mMEDTA)

7、稀释(总体积约120m1)；取4个干净的50ml离心管，分别加入17mlFic011，将上述血细胞混合液以30ml／管小心加至Fieoll上层，1800转离心20min，弃2／3血浆，转移白膜层至新的50ml离心管中；用BufferI补齐至约40ml，1200转离心8min，弃上清，BufferI重悬沉淀细胞团，将所有细胞混合至一个离心管中，BufferI洗两遍，弃上清；300ulBufferII(PBS含2mMEDTA，0．5％BSA)重悬细胞，依次加入100ulFcRblockingreagent和100ulCDl33+分选磁珠，

8、轻轻混匀后，4℃孵育30min，加入BufferII至15ml终止反应，1200转离心10min，弃上清，500ulBufferII重悬，准备过柱；分选柱置于磁铁架上，用lmlBufferII润柱，加入细胞悬液过柱，再用