rtpcr检测外周血中肝癌细胞

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1、使用前删除此我爱浪漫樱花文档主页：http://www.docin.com/mtl168168，分享文档快乐生活快乐无阻浅谈　　摘要:应用rt-pcr技术检测外周血中肝癌细胞是近年发展起来的新方法，白蛋白mrna和afpmrna为肝组织特异表达，通过检测这二个转录子作为肝癌细胞存在于外周血的标记，有助于判断肝癌的转移、复发。本文综述了近年有关这方面的研究进展。　　肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma,hcc.以下简称肝癌）是最常见的消化道恶性肿瘤之一，在肝切除术后和肝移植术后再发率仍达50％以上1。因此，多数学者认为在手术之前患者外周血中已存在肿瘤细胞或

2、已发生微转移而影像学诊断又未发现；也有学者推测可能是手术过程导致了肝癌的细胞播散。肝癌细胞的血源性播散是肝癌肝外转移的主要方式，所以在治疗前检测外周血中是否存在肝癌细胞可能是患者肿瘤复发、转移和预后的重要指标。近年兴起的逆转录酶-聚合酶反应（reversetranscriptasepolymerasechainreaction,rt-pcr）具有敏感性高、特异性强的优点，使检测外周血中的少量癌细胞成为可能，国外学者已相继报道利用rt-pcr技术在多种实体瘤患者外周血中成功地找到肿瘤细胞2。本文集中对外周血中检测肝癌细胞的研究作一综述。　　1原理和方法9使用前删除此我爱浪漫樱

3、花文档主页：http://www.docin.com/mtl168168，分享文档快乐生活快乐无阻　　rt-pcr技术是以rna为模板，在逆转录酶的作用下，由人工合成引物介导生成cdna第一链，以此再作为聚合酶链反应的模板，在taqdna聚合酶作用下，扩增产生大量特异dna片段。检测外周血中肿瘤细胞的依据是：由于血浆中富有大量的rna酶，一旦血浆中出现rna即会被降解，故血浆中不会有游离的mrna，因此通过rt-pcr技术检测到的mrna显然来自外周血中完整的循环细胞，选择恰当的靶mrna是决定检测结果是否可靠的重要因素。目前，由于缺乏肝癌特异表达的mrna，因此，肝组织特

4、异性表达的白蛋白mrna和甲胎蛋白（α-fetoprotein,afp）mrna被用于肝癌细胞的检测。　　rt-pcr技术检测外周血肝癌细胞的一般步骤如下3,4,5：①静脉取血去除红细胞，收集有核细胞用于提取总rna，或用淋巴分离液密度梯度离心纯化有核细胞，癌细胞与单核细胞在同一密度层。②异硫氰酸胍一步法提取细胞总rna。③rt-pcr反应，分为一次pcr和套式pcr。④结果检测，简单方法是电泳分离染色观察扩增带；为增加试验的敏感性和特异性，更多学者采用分子杂交的方法确定阳性结果。　　2外周血白蛋白mrna的检测9使用前删除此我爱浪漫樱花文档主页：http://www.do

5、cin.com/mtl168168，分享文档快乐生活快乐无阻　　carr等在1991年美国肝病研究协会第42届年会上首次报告利用rt-pcr技术检测白蛋白mrna以确定外周血中的肝癌细胞，结果表明在17例晚期患者中16例阳性，其中6例肝移植术后外周血白蛋白mrna水平降低甚至消失，而2例术后白蛋白mrna水平不变的患者出现肿瘤复发。同时检测的6例健康对照、10例肝硬化患者及10例肝硬化行肝移植术的病人均为阴性6。hillaire和黄智铭等也得到相似的结果，统计学分析表明白蛋白mrna阳性率与肝癌的临床分期、肿瘤的转移、复发相关3,7。　　随着更多实验室开展外周血白蛋白mrn

6、a的研究，越来越多的资料表明白蛋白mrna作为肝癌患者外周血中癌细胞的标志是不适宜的，其表现在三个方面：首先，在良性肝病、健康对照人群发现不同程度的阳性检出率。louha5、chou8、　matsumura10、muller9、wong11、ng12等人的结果证实了这一点，他们分别在5例、6例、8例、26例、9例、3例健康对照的外周血中检测到白蛋白mrna；同时，muller9的结果还表明在慢性肝病组织阳性率为88％（22/25），急性肝病组织为94.7％（18/19）。其次，部分良性肝病患者切除术后外周血白蛋白mrna呈阳性。9使用前删除此我爱浪漫樱花文档主页：http:

7、//www.docin.com/mtl168168，分享文档快乐生活快乐无阻ijzermans13等对5例良性肝病患者切除前后分析表明，术前外周血中均无白蛋白mrna转录，而术后24h内均阳性，作者认为白蛋白mrna可能是由于手术操作导致正常肝细胞释放进入血液循环造成的。其三，外周血白蛋白mrna阳性与肝癌患者临床资料不相关，无临床指导意义。barbu14等将101例肝病患者依是否外周血中转录白蛋白mrna分为二组，比较二组间肿瘤大小、个数、有无门静脉瘤栓及肝外转移等各项临床资料，统计学分析表明二组间无显著差异（注