肝癌患者外周血中循环肿瘤细胞的检测及其生物学特性

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1、第三军医人学博士学位论文肝癌患者外周血中循环肿瘤细胞的检测及其生物学特性摘要目的：肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是临床上最常见的恶性肿瘤之一，以其高发病率和高度恶性行为著称，占我国癌症死亡率的第二位，肿瘤切除或肝移植是治疗该病的最有效手段，但术后复发转移率高严重影响了治疗的效果。部分肝癌病人在肝癌切除或肝移植前，已有肿瘤细胞脱落进入血循环系统中，入血的循环肿瘤细胞(circulatingtumorcell，CTc)是导致肝癌术后复发和转移的首要条件。因此，检测循环肿瘤细胞并研究其细胞生物学特性对判断肝癌的转移复发、指导临床

2、治疗具有重要意义。大多数学者在肝癌患者外周血中检测AFPmRNA，作为判断循环肿瘤细胞的指标，但部分肝炎或肝硬化的患者检测结果提示该方法假阳性率较高，其特异性令人难以满意，且单标志物检测可能出现假阴性。研究显示端粒酶大多数(85一lOO％)的肿瘤细胞中表达，多数正常体细胞不表达，而人端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase，hTERT)是合成端粒酶的限速亚基，对端粒酶活性调控起着决定性的作用。hTERT表达在AFP阴性的肝癌中也有很高的发生率，hTERT表达阳性诊断肝癌的敏感性为73．9％，特异性为100％，显示

3、hTERT的基因表达是比端粒酶更敏感的诊断指标。因此我们推测hTERTmRNA做为循环肿瘤细胞检测的标志物，可避免合并肝炎或肝硬化的肝癌患者中假阳性的干扰，应具有良好的癌特异性。免疫磁珠(Immunomagneticbead，IMB)技术是近年来发展起来的一项新的免疫学技术，免疫磁珠细胞分离是应用最主要的一个方面，具有简便易行、分离纯度高、特异性高、同时保留细胞活性的优点。与常规检测技术(如免疫细胞化学、I汀PCR、流式细胞仪等)相结合，能在10n7个单核细胞中分离检测出一个肿瘤细胞，可弥补这些技术的不足，并改善这些技术对循环肿瘤细胞检测的敏感性及特异性。因

4、此，本研究以肝细胞癌为研究对象，在构建肝细胞癌免疫磁珠的基础上，联合免疫细胞荧光技术进行循环肿瘤细胞形态学分析，以及巢式lmPcR技术联合检测AFPmRNA和hTERTmRNA，并尝试对富集分离出来的循环肿瘤细胞进行培养，为检测及防治肝癌的血液转移提供理论依据和方法。方法：(1)利用碳二亚胺偶联法，在磁珠上包被单抗HAbl8，制备肝癌免疫磁珠第三军医人学博十学何论文后，将微量肝癌HepG2细胞与外周血单个核细胞悬液混匀，再通过免疫磁性细胞分离，行免疫细胞化学鉴定，检测免疫磁珠的特异性和敏感性，并计算癌细胞的回收率。(2)采集肝癌患者56例、肝炎和肝硬化患者1

5、9例、继发性肝癌患者11例血样，及18个健康志愿者的血样作为阴性对照。用Ficoll密度梯度离心与免疫磁珠技术首先对患者的外周血进行癌细胞的富集，然后运用FITC—CK标记富集的癌细胞，免疫细胞荧光技术对循环肿瘤细胞行形态学分析，并用巢式RT—PCR技术联合检测AFPmRNA和hTERTmRNA。(3)对8例富集分离出来的循环肿瘤细胞进行培养，通过测定生长曲线和细胞倍增时间评估细胞生长增殖能力，锚着独立性试验了解克隆集落能力，扫描电镜观察细胞表面超微结构，以及裸鼠移植及成瘤观察等方法研究其细胞生物学特性。结果：(1)包被HAbl8的免疫磁珠能与HepG2细胞

6、敏感而特异地结合，当单个核细胞与HepG2细胞比为1×106：l时可检测到癌细胞，结合免疫细胞化学方法可检出外周血单个核细胞中57．2％的微量癌细胞，无假阳性。(2)在用肝癌HepG2细胞所做的2组预实验中，免疫磁珠联用增强了巢式RT—PCR的灵敏度、特异性，其灵敏度为5ml血中含有一个癌细胞。(3)在临床样品的实验中，免疫磁珠富集后，结合免疫细胞荧光方法观察肝癌患者外周血中循环肿瘤细胞，检出阳性率为42．9％(24／56)，并与肿瘤的TNM分期有关；检出细胞的形态可分为四类：中等细胞型、大细胞型、有核细胞碎片和无核细胞碎片。(4)肝癌患者外周血中AFPmR

7、NA及hTERTmRNA的检出阳性率分别为55．4％、48．2％。AFPmRNA及hTERTmRNA的检出率和TNM分期、远处转移临床参数密切相关。当肝癌直径大于5cm、多结节、伴门静脉癌栓，AFPmRNA及hTERTmRNA的检出率均明显提高(P<0．05)。血清AFP水平、肝癌分化程度等与AFPmRNA及hTERTmRNA的检出率无显著相关(P>O．05)。67．9％的肝癌患者至少表达一种标志物，35．7％的患者两种标志物均阳性。AFPmRNA和hTERTmRNA的检出呈『F相关，相关系数为0．363(P<0．05)。hTERTmRNA在AFPmRNA阳

8、性和阴性的肝癌患者检出率分别为64．5％、28％(P