外周血白细胞中dna提取与检测

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1、试验一外周血白细胞中DNA的提取与检测1.掌握真核细胞中DNA制备原理。2.熟悉从外周血白细胞中提取DNA的方法。3.掌握紫外分析仪检测DNA的原理。一、实验目的二、实验原理破碎细胞DNA提取检测STMT破碎红细胞及白细胞的细胞膜→离心收集白细胞核→SDS破膜苯酚氯仿抽提、乙醇沉淀洗涤琼脂糖凝胶电泳，紫外分析仪检测三、仪器试剂1、主要器具Eppendorf离心管电泳槽与电泳仪紫外分析仪台式离心机微量移液器2、主要试剂STMT：（蔗糖、Tris-HCl、MgCl2、TritonX-100）NE：（NaCl、EDTANa2

2、）TE：（Tris-HCl、EDTANa2）SDS苯酚氯仿乙醇：无水乙醇、70%乙醇四、操作步骤吸去血清，混匀含有EDTANa2的抗凝全血→取0.3mL至EP管（1）→加1mLSTMT，混匀→离心（12000rpm1-2min），弃上清→加1mL0.9%NaCl洗涤离心,弃上清（12000rpm1-2min）→加460μLNE,充分吹散沉淀→加35μL10%SDS，轻轻混匀。1、破碎细胞：2、DNA提取：加等体积苯酚，轻摇1min→离心（12000rpm3-5min）→吸取上层水相于另一EP管（2）→加1/2体积苯酚+

3、1/2体积氯仿-异戊醇，轻摇1min→离心（12000rpm1min）→取上层水相于另一EP管（3）→加等体积氯仿-异戊醇→离心（12000rpm1min）→取上层水相于另一EP管（4）3、沉淀DNA加1/10体积3MNaAC，混匀→加1mL无水冰乙醇→置-20℃冰箱，0.5-1h→离心（12000rpm5min）→弃上清→加70%冷乙醇1mL洗涤→离心（12000rpm5min）→弃上清→自然干燥→加50μLTE溶解，室温1h。4、电泳制胶：0.8%的琼脂糖凝胶（琼脂糖0.32g+TBE40ml，混合，加热熔化，冷至

4、60℃，加EB20μL,制胶）加样：DNA样品10μL+载样缓冲液2μL，混匀，取10μL点样电泳：点样端接负极，100V，40min紫外分析仪下观察结果电泳结果图五、注意事项1、注意安全（苯酚具有强腐蚀性），操作戴手套；2、所用玻璃器皿及溶液需经高压灭菌处理；3、混匀试剂、吸取上清等操作时应动作要轻柔,避免动作剧烈；4、离心分离两相时，应保证一定的转速和时间，且吸取上清时注意不要吸取到中间层及有机相；5、沉淀后注意不要将DNA沉淀倒掉。谢谢各位