不同海拔高原地区严重烫伤延迟复苏大鼠肺组织细胞凋亡及基因调控机制

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1、不同海拔高原地区严重烫伤延迟复苏大鼠肺组织细胞凋亡及基因调控机制【摘要】目的：探讨不同海拔的高原地区严重烫伤延迟复苏后肺组织细胞凋亡及其基因调控机制.方法:雄性Wistar大鼠240只,分别在1517m和3848m海拔高度随机分为延迟复苏组(DFR,n=50),即时复苏组(IFR,n=60)和对照组(n=10),建立总体表面积30%的Ⅲ度烫伤模型,分别于伤后1,6,12,24,72和168h取材.采用组织病理学、组织芯片技术、原位末端标记（TUNEL）法、免疫组织化学染色与图象分析技术,观察肺组织病理学改变与细胞凋亡及Bcl2和HIF1α的表达.结果:随海拔的增加,肺泡壁明显增

2、厚,毛细血管内皮肿胀,肺泡腔中出现水肿液且有炎性细胞浸润,DFR组较IFR组差异有统计学意义(P<0.05),肺泡上皮细胞凋亡逐渐增多,各海拔高度DFR组均较IFR组变化大(P<0.05).Bcl2与HIF1α的阳性表达均位于肺泡上皮细胞的细胞核或胞浆,其表达强度实验组高于对照组(P<0.05),随海拔梯度上升Bcl2表达增强,各海拔高度DFR组Bcl2表达强度高于IFR组（P<0.05）.细胞凋亡与Bcl2和HIF1α表达强度的变化呈正相关(r=0.872,0.945,P<0.05).结论:高原地区严重烫伤延迟复苏大鼠肺组织细胞凋亡数量随

3、海拔梯度升高而增加,Bcl2和HIF1α对细胞凋亡具有调节作用.【关键词】烧伤；复苏术；肺泡/细胞学；上皮细胞；TUNEL；HIF1α；组织芯片；免疫组化；高原90引言近年的研究表明,多种脏器在发生缺血再灌注损伤时会出现细胞凋亡［1-2］,但对于高海拔地区严重烫伤延迟复苏后大鼠肺组织的细胞凋亡及其基因调控机制,尚无文献报道.本实验通过建立高海拔地区大鼠严重烫伤延迟复苏模型,应用组织芯片技术［3-4］、原位末端标记技术、免疫组织化学染色和图象分析技术,研究高海拔地区严重烫伤延迟复苏大鼠肺组织细胞凋亡及其可能的调控机制.1材料和方法1.1材料健康雄性Wistar大鼠240只(兰州

4、军区兰州总医院动物实验科提供),体质量(250±30)g,致伤前1wk,置室温19～25℃.实验前24h用电推推去背部被毛,单笼饲养.实验前12h禁食、水.10mg/L戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉,分别在中度高原(1517m)和高原(3848m)地区建立大鼠背部30%Ⅲ度烫伤模型(病理证实),致伤条件为90℃,20s.每一海拔梯度随机分3组:即时复苏组(IFR,n=60),即刻腹腔注射等渗盐水4mL/kg;延迟复苏组(DFR,n=50),6h后腹腔注射等渗盐水4mL/kg;正常对照组(n=10),模拟烫伤,不补液.原位末端标记试剂盒:TUNEL(3%H2O2,柠檬酸缓冲

5、液,TBS,9封闭液生物素化抗体和地高辛抗体,DAB显色剂等)由武汉博士德生物工程有限公司提供.HIF1α:兔多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司),工作浓度1∶100;Bcl2：鼠单克隆抗体(北京中杉生物工程有限公司)工作浓度1:100;SP试剂盒(北京中杉生物工程有限公司,武汉博士德生物工程有限公司);彩色病理图文分析系统(同济医科大学千屏影像工程公司);组织芯片制作仪(朝阳恒泰科技发展有限责任公司).1.2方法1.2.1取材伤后1,6,12,24,72,168h,每组取10只动物,将大鼠处死,迅速开胸,于肺尖部切取0.5cm×0.5cm×0.5cm大小组织,10%甲醛固

6、定,置4℃冰箱.对照组同上述方法.1.2.2组织芯片的制备应用组织芯片制作技术制备42（6×7）点列阵的组织芯片,即由实验组各时相点肺组织标本与相应海拔梯度对照组肺组织标本组成.具体操作如下:①所有标本经中性福尔马林固定,56～58℃熔点石蜡包埋,3～4μm切片,经苏木素伊红染色,复核病理诊断,并在切片上标记出典型的病变区域;②用组织芯片制作仪的针孔芯针在无组织的空白蜡块上钻孔(直径1.8mm);③借助玻片上的标记找准蜡块上的相应部位,用组织芯针采集组织芯;④将组织芯转移到空白蜡块中相应的孔中,如此反复将数百个组织芯整齐有序安插在空白的蜡块中,就制成了组织芯片蜡块;⑤9空位Mar

7、ker选用两个正常的肝脏组织,位于芯片的一角.1.2.3病理学观察将不同海拔高度实验组、对照组肺组织标本石蜡包埋、切片、HE染色，显微镜下观察照像.1.2.4免疫组织化学分析采用SP法免疫组织化学染色,按试剂盒操作说明进行,DAB显色,苏木素复染.对照组用PBS液代一抗.免疫组化定量分析:每张切片随机选5个高倍视野,测每个视野阳性信号平均灰度值.反应免疫组化染色越深,灰度越小,即阳性表达越高.统计学分析:采用SPSS10.0统计软件,计量资料用x±s表示;组间比较采用