清肺渗湿汤对哮喘大鼠肺组织淋巴细胞上凋亡调控基因

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1、清肺渗湿汤对哮喘大鼠肺组织淋巴细胞上凋亡调控基因【摘要】目的观察清肺渗湿汤对哮喘大鼠肺组织淋巴细胞上凋亡调控基因Fas/FasL表达的影响。方法将清洁级雄性ethods60ratslydividedintofivegroups,theyagroup,hexadrolgroup,QingfeishenshiDecoctiongroupandMashingshigandecoctiongroup.Bronchialasthmainacuteepisodemodelannerofeggalbumensensibiliz

2、ationandprovocation.Ratsineachgroupmunehistochemistry.ResultsProteinexpressionofFas/FaL-sinlungtissueinhexadrolgroup,QingfeishenshiDecoctiongroupandMashingshigandecoctiongroupotingapoptosisoflocallymphocytebypotentiationofgeneexpressionofFas/FaL-sofmodulating

3、apoptosisportantmechanismofQingfeishenshiDecoction,matoryreactionofbronchialasthma.　　【Keyphocyte;Asthma;Apoptosis;Geneexpression;Membraneglucoprotein;Biosynthesis;DiseaseModel;Animal“病热痰者当须渗利”是周兆山教授根据中医学“治病必求于本”思想提出的治疗支气管哮喘(热哮证)的创新性理念［1］，清肺渗湿汤是对这一理念的具体实践。清肺渗湿

4、汤以麻杏石甘汤为基础，配合薏苡仁、茯苓、车前草、石韦等利水渗湿药，有宣肺化痰、渗湿利水之效。前期的临床研究已证实此方具有确切的临床效果［1］。我们通过观察清肺渗湿汤对哮喘大鼠肺组织淋巴细胞上Fas/Fas-L表达的影响，从细胞凋亡调控的角度探讨了清肺渗湿汤起效的分子生物学机制。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1实验动物　　60只清洁级健康雄性L。　　1.1.2.2试剂　　卵白蛋白冻干粉10g/支(GradeII，sigmaA5253)，由华美生物工程公司上海分公司分装，批号：040402，配制成10%和

5、1%溶液，过滤消毒后置4℃冰箱保存备用。一抗：Fas兔抗鼠多克隆抗体、Fas-L鼠抗鼠单克隆抗体由武汉博士德生物工程有限公司提供；二抗：非生物素检测试剂盒由北京中山生物技术有限公司提供；DAB显色剂由北京中山生物技术有限公司提供。　　1.1.3主要仪器　　超声雾化器(江苏鱼跃医疗设备有限公司，标准号Q/3211812YQ007-2000)；NikonYS100型光学显微镜；微量移液器(GILSON)；微量移液器吸头：20、200、1000μL(GILSON)；1.5mL微量离心管(eppendorf管，GILSO

6、N公司)；RAK-2001耐高温抗原修复盒(南京生物工程有限公司)；免疫组化孵育盒和PBS冲洗瓶(福州迈新公司)；PYX-DHS-X隔水式电热恒温培养箱(上海市跃进医疗器械厂)；Bs110型型电子天平(Sartorius公司)。　　1.2动物模型制备　　实验大鼠随机分为5组，每组12只。分别为正常对照组、哮喘模型组、地塞米松组、清肺渗湿汤组、麻杏石甘加味汤组。哮喘模型组和各药物干预组均于实验第1日、第8日和第15日共3次在腹腔分2点注射10%卵白蛋白并0.9%氯化钠注射液致敏；第3次致敏1周后，每日以1%卵白蛋白

7、并0.9%氯化钠注射液对模型组和药物干预组动物进行超声雾化吸入，诱发其哮喘发作，连续激发7日。正常对照组予0.9%氯化钠注射液代替抗原进行致敏和激发。　　1.3给药方法　　5组均从激发阶段的第1日起开始给药，正常对照组和哮喘模型组均予0.9%氯化钠注射液灌胃30g/kg；地塞米松组用地塞米松片1mg/kg；其他2组分别予清肺渗湿汤和麻杏石甘加味汤灌胃30g/kg。各组均连续给药7日。　　1.4标本的采集及免疫组化方法步骤　　心脏取血后处死动物，剥离肺脏，无菌操作下切取大鼠左侧肺组织，以4%的多聚甲醛固定，常规石蜡

8、包埋切片，HE染色，然后将石蜡切片进行脱蜡脱水、热修复、酶消化等处理，在此基础上分步骤滴加一抗、二抗工作液，并进行标记、染色和封片。　　1.5免疫组化评分标准　　肺组织淋巴细胞上Fas、Fas-L蛋白表达，阳性反应物质呈棕黄色，主要位于胞浆中，也可见细胞膜表达，Fas、Fas-L免疫组化染色的评分均采用Bresalier［2］的半定量公式。每张切片随机观察10个高倍视野(