哮喘大鼠肺组织akt蛋白表达上调对il

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1、哮喘大鼠肺组织Akt蛋白表达上调对IL：徐慧，戴元荣，夏晓东，吴成云，何建波【摘要】目的：研究Akt蛋白对支气管哮喘大鼠IL-4，IL-12和IL-13表达的影响。方法：雄性SD大鼠24只，随机分为3组：对照组(C组)、哮喘组(A组)、渥曼宁青霉素组(ethods:TaleadultSprague-Dalydividedintothecontrolgroup(C)，theasthmagroup(A)andaxvisionTM法(福州迈新生物技术有限公司)说明书操作步骤进行操作。对照试验选用PBS代替一抗，其他步骤相同。用image-proplus

2、图像分析软件测定阳性部位的平均吸光度。　　1.5g，PBS润洗，加预冷的in，取上清，超声5s×4次破碎细胞核，超速离心后收集上清。②BCA法测定肺组织匀浆总蛋白浓度。③蛋白质电泳和印迹电转移：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳配置质量分数为10%的分离胶和5%的浓缩胶，电泳条件：恒压，先80V，待溴酚蓝到达分离胶后改电压为120V，直至溴酚蓝跑到凝胶底部。电泳结束后进行印迹转移，应用NC膜300mA恒流电转60min，转移完毕后分别用立春红和考马斯亮兰染膜和胶。④in，TBST洗膜，加入5%脱脂牛奶稀释的兔抗大鼠p-Akt多克隆抗体(1:800)，4℃

3、过夜，次日加入5%脱脂牛奶稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗兔二抗(1:1000)，同时加入GAPDH(1:10000)，洗膜后，ECL显色、胶片曝光，用QuantityOne凝胶软件分析系统分析计算其灰度值。　　1.6统计学处理方法组间比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐者用LSD检验，方差不齐采用Dunt’sT3检验，两变量的相关分析用Pearson直线相关分析法。　　2结果　　2.1各组大鼠BALF液中IL-4，IL-13和IL-12浓度比较BALF中IL-4，IL-13的含量A组明显高于C组，W组IL-4，IL-13的含量低于A组

4、，但仍高于C组;BALF中IL-12的含量A组明显低于C组，W组IL-12的含量低于C组，但仍高于A组。详见表1。　　2.2各组大鼠肺组织p-Akt蛋白免疫组化检测结果p-Akt蛋白表达于细胞浆和细胞核，主要表达的细胞有支气管上皮细胞、气道平滑肌细胞及散在的炎性细胞。免疫组化结果显示，A组有强阳性表达，而C组只有极少量表达，A组表达量明显高于C组(P<0.01);W组有阳性表达，但较A组弱，p-Akt活化量明显低于A组(P<0.01)，高于C组(P<0.01)。详见表2。　　2.3各组大鼠肺组织p-Akt的Westernblot

5、检测结果根据总蛋白浓度，电泳上样量为50μg，A组光密度值明显高于C组(P<0.01)，W组的光密度值明显低于A组(P<0.01)。详见表3。　　2.4相关性分析肺组织匀浆中p-Akt蛋白含量与BALF液中IL-4(r=0.845)及IL-13浓度(r=0.849)之间均呈显著正相关，而与IL-12浓度(r=-0.917)间存在显著的负相关关系(均P<0.01，均n=18)。　　Farghaly等[5]通过实验证明，IL-13引起支气管气道高反应是通过IA类PI3KP110δ催化亚单位介导的。在这一实验中，研究者将支气管组织与I

6、L-13一起孵育，结果发现，支气管组织出现了PI3K活性的增高，即检测到p-Akt水平的增加，同时出现了支气管收缩性的增加，而加用PI3K特异性抑制剂——渥曼宁青霉素则能抑制IL-13引起的这种气道高反应性。另有研究发现，Th1/Th2平衡受到PI3KIA类调节亚单位P85的影响[6]，IA类PI3K能诱导Th2反应，抑制Th1反应。PI3K已经被证明是树突状细胞产生IL-12的内源性抑制剂[7]，在体内实验中，敲除了p85α基因的脾和骨髓所衍生的树突状细胞比野生型的树突状细胞能产生更多的IL-12[8]，树突状细胞过度产生IL-12可能导致免疫

7、平衡向Th1方向偏离。此项研究表明PI3K是通过控制IL-12的产生来调节Th1/Th2平衡关键点之一。　　本实验用免疫组化和youS,LeffAR,MyoS,etal.Blockadeofinflammationand　　airmunesensitizedmiceby　　dominantnegativephophoinositide3-kinase-TAT[J].Exp　　Med,2003,198(10):1573-1582.　　[5]FarghalyHS,BlagbroughIS,Medina-TatoDA,etal.　　Interleuki

8、n13IncreasesContractilityofMurineTracheal　　SmoothMusclebyaPhosphoino