不同潮气量机械通气对ali大鼠肺组织细胞凋亡影响的实验研究

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1、不同潮气量机械通气对ALI大歐肺组织细胞凋亡影响的实验研宄陈宁1白杰1董谞楣1崔娜1王惠凌1石立英2（1.河北大学附属医院ICU071051；2.河北保定市第三屮心医院071051）【摘要】目的研宄不同潮气量机械通气对急性肺损伤（ALI）大鼠支气管和肺组织细胞凋亡的影响，并初步探讨细胞凋亡在呼吸机相关性肺损伤（V旧）屮的作用机制。方法选用40只SD大鼠，制作AU模型，随机分组：①小潮气量组（LV组）：潮气量8ml/kg，不加PEEP;②大潮气量组：潮气量30ml/kg，不加PEEP（呼气末正压）；通气2h后处死动物，留取肺标本。用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的末端标记法（TUNEL）分

2、析肺组织屮的细胞凋亡情况，用免疫组化法检测肺组织屮caspase-3蛋G的表达及分布。结果大潮气量组肺组织支气管和肺组织细胞凋亡的明显增加（p<0.01）,caspase-3蛋白酶表达最强。结论小潮气量对肺组织有保护作用，细胞凋亡在VIU的发生屮有重要作用。【关键词】急性肺损伤；机械通气；细胞凋亡；caspase-3蛋白机械通气是目前治疗急性肺损伤（ALI）/急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的呼吸支持技术，但机械通气不当会诱发或加重肺损伤，称为呼吸机相关性肺损伤（VILI）[1]。近年来有关VILI的发生机制成为医学界研宂的热点之一，但是其确切机制尚不完全清楚，需要进一步阐明。机械通气与

3、细胞凋亡的研究虽然已被关注，但是有关的文献报道很少。本实验通过建立AU的动物模型，分别应用不同潮气量8ml/kg和30ml/kg进行通气治疗，观察肺组织细胞凋亡情况，探讨潮气量对肺组织的影响。1资料和方法1.1ALI动物模型的建立健康雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠，体重270〜320g（购自河北大学实验动物屮心）。术前称重，将各组大鼠用10%水合氯醛腹腔内注射麻醉后，取仰卧位，置于手术台上。分离颈动脉、颈静脉；行动脉、静脉插管，以备测血气。应用静脉内注射汕酸制作急性肺损伤模型，剂量为O.lml/kg，用lml微量注射器抽取进行静脉注射，静脉注射后3〜5min,大鼠呼吸增快

4、、鼻翼煽动、呼吸费力、U腔黏膜和四肢末梢紫钳。抽取动脉血气以氧合指数Pa02/Fi02≤300，作为急性肺损伤模型成功的指标。模型建立后分离气管，气管切开插管，连接动物用呼吸机（成都泰盟HX-300S型动物呼吸机）。1.2机械通气40只大鼠随机分为2组（n=20）：①小潮气量组（LV组）:潮3量8ml/kg;不加PEEP;②大潮气量组：潮气量30ml/kg;不加PEEP。各组大鼠除潮气量设置外，呼吸频率小潮气量组：70次/分，大潮气量组：50次/分；吸呼比（kE）:1：2,FiO2为1.0。1.3标本米集通气2h后,经动脉插管放血处死大鼠后，立即开胸取出完整的肺组织，用滤纸吸干血

5、污。取左肺中部肺组织，用多聚甲醛固定，石蜡和环氧树脂包埋，作病理切片。1.4采用TUNEL法原位检测肺组织细胞凋亡用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的末端标记法（TUNEL）分析肺组织中的细胞凋亡情况，通过原位测定肺组织切片中的DNA片段对损伤的肺组织中细胞凋亡的程度进行评价。TUNEL分析试剂盒购自德国宝灵曼公司。步骤如下:切片常规脱蜡脱水，用蛋白酶K37°C孵育15min;随后滴加50ul的TUNEL反位混合溶液，在湿盒中37°C孵育60min；再加入50ul转化剂-POD,在湿盒中37°C孵育30min;加入50〜100μlDAB底物溶液，室温孵育10min,苏木素复染细胞核，

6、封片。细胞棕黄色染色者为阳性细胞，在400倍光镜下每张切片以随机数字表法随机观察10个高倍视野。计算每高倍视野中阳性细胞数和该高倍视野中细胞总数的比值，以百分数表示，即凋亡指数（apoptosisindexAI）。1.5免疫组化法检测肺组织中caspase-3蛋白的表达兔抗caspase-3抗体购于北京中山生物技术公司。滴加一抗后，4°C过夜，同吋用PBS代替一抗而其他条件均相同作阴性对照，滴加二抗后37°C20min,然后滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，DAB显色，苏木精复染封片。caspase-3阳性细胞胞浆呈棕黄色，每张组织切片取5个高倍视野，计数阳性细胞总数，取其均值，以阳性细

7、胞数/高倍视野表示。1.6统计学处理采用SPSS11.5统计学软件进行数据分析，计量资料以均数&pluSmn;标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，若p<0.05认为有统计学意义，进一步进行SLD-t检验，若p<0.05认为差异显著。图1LV组TUNEL分析结果(400×)图2LV组caspase-3蛋白在支气管上皮的表达(400×)uC,RichardsonJA,etal.AdultApaf-