文昌鱼分子生物学：AmphiHMGB、AmphiUbf80和AmphiPrxV基因克隆、表达与进化研究

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1、中国海洋大学博士学位论文文昌鱼分子生物学：AmphiHMGB、AmphiUbf80和AmphiPrxV基因克隆、表达与进化研究姓名：刘振辉申请学位级别：博士专业：海洋生物学指导教师：张士璀2003.6.1}I围海洋大学博一l：学位沦文摘要在动物的进化历程中，文昌鱼是介于无脊椎动物与脊椎动物之间的过渡类型。利用分子生物学手段，研究文昌鱼有关基因的结构、进化和表达，可为我们从分子水平上解开脊椎动物起源的奥秘；更重要的是，将进化与发育联系起来，可以更清楚地揭示有关基西在发育中的作用。本文应用SMART⋯eDNALibraryConstructionKit的方法

2、，以成体文昌鱼肠为研究材料，构建了以真核表达载体pcDNA3为基础的eDNA表达文库。埘文库克隆进行序列测定和生物信息学分析，已经获得了54个克隆。代表了文昌鱼至少39个不同的基因。有14个克隆包含有完整的开放阅读框，其中包括抗氧化物酶基因Prx、DNA结合蛋白基因、泛素基因、信号识别蛋白基因、溶菌酶基因和乙酰基转移酶基因等具有重要生物学功能的基因。文昌鱼肠cDNA表达文库的成功构建，为从分子生物学水平研究文昌鱼的进化与发育奠定了基础，也是分离新基因的重要来源。从文昌鱼肠c1)NA文库中分离到的克隆S028、S004和089，利用生物信息学方法对其进行了

3、分析。结果表明，S028cDNA序列编码一个164个氨基酸的蛋白，其与线虫、果蝇、鲑鱼、虹鳟和鸡HMG(high-mobility～group)蛋白同源性达47—53％，且该蛋白具有2个保守的HMG盒(boxA和boxB)，属于HMGB亚家族，我们把该克隆命名为AmphiHMGB。文昌鱼AmphiHMGB蛋白不含C一端酸性尾巴，为一碱性蛋白，等电点为9．88。S004c1)NA序列编码一个156个氪基酸残基组成的蛋白质，与人的泛素蛋白UbfSO具有较高的氨基酸序列同源性(145／156同源)，且该蛋白具有泛素蛋白Ubf80所共有的两个结构域，即由72个氨

4、基酸组成的泛素介导的蛋白降解结构域和由48个氨基酸组成的核糖体蛋白$27a结构域。我们将这个cDNA克隆命名为AmphiUbf80。089cDNA序列编码一个188个氨基酸残基编成的蛋白质，与人AOEBl66蛋白(PrxV)的同源性达657．。我们将这个cDNA克隆命名为AmphiPrxV。通过对HMGB基因的系统进化分析，发现文昌鱼AmphiHEG8基因可能摘要代表了脊椎动物HMGBI、HMGB2和HM683基因分化前的一种前体基因型。通过对ubiquitin的系统进化分析，发现文昌鱼Ubf80除了具有脊椎动物和无脊椎动物的特征外，还具有自己的一些独特

5、的特征，从分予水平上支持了文昌鱼是脊索动物进化过程中的一侧枝的观点。发现文昌鱼AmphiPrxV基因是具有线粒体和过氧化物酶体信号特征(mitochondrialandperoxisomalsortingsignalS)的抗氧化物酶基因：通过序列比对，我们把PrxV归为1一Cys和2一Cys之外的3一Cys类，从而把Prx基因家族的两种分类方法统一了起来。通过Northernblot、Dotblot和原位杂交等技术，研究了文昌鱼月J】，口^iHMGB基因的表达图式。Northernblot和Dotblot杂交显示该基因在成体不同组织中表达差异性很大：卵巢

6、表达最强，肠次之。而在肌肉、脊索和精巢中未检测到杂交信号；在胚胎发育的不同时期表达也存在差异：卵裂期、囊胚期和原肠胚期表达较强。而在神经胚期和1天幼虫期表达减弱。原位杂交分析表明从受精卵到神经胚，AmphiHMGB基因广泛表达，但随着发育的进行，中胚层、内胚层和神经管的表达减弱，到l天幼虫期，仅在表皮可检测到表达。AmphiHMGB转录子在胚胎发育早期的丰富存在表明AmphiHMGB可能在文昌鱼胚胎的有丝分裂中发挥重要的作用。关键词：青岛文昌鱼，AmphiHMGB，AmphiUbfSO，AmphiPrxV,基因克隆，系统进化分析，表达图式中嘲海洋_大学蚺

7、士学位论文ABSTRACTAmphioxusorlancelet，aeephalochordate，haslongbeenregardedasthelivinginvertebratemostcloselyrelatedtotheproximateinvertebrateancestorofvertebratesIthasbeenrecognizedasthemostimportantmodelanimaltoanalyzetheoriginandevolutionofvertebrates．Studyonthegenestructure，functio

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