分子生物学大实验-目的基因的克隆和表达

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1、分子生物学大实验——目的基因的克隆及表达第一节基因操作概述2一、聚合酶链式反应(PCR)2二、质粒概述4三、凝胶电泳5四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化6五、重组质粒的连接7六、限制性内切酶消化7七、SDS-PAGE蛋白质电泳7第二节材料、设备及试剂7一、材料8二、设备8三、试剂：9第三节操作步骤10一、目的基因的获得：10二、pET-21bT（pET-21bR、pET-21b）载体的获得：11三、pET-21b等与目的片段的连接作用12四、转化大肠杆菌DH5α进行阳性克隆子筛选与鉴定13五、转化转化大肠杆菌BL21plyst，摇菌进行SDS-PAGE电泳。14六、

2、融合蛋白的毒力测定16第四节本实验的实验报告1616第一节基因操作概述一、聚合酶链式反应(PCR)PCR(PolymeraseChainReaction，聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括三个基本步骤：(1)变性(Denature)：目的双链DNA片段在94℃下解链；(2)退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对；(3)延伸(Extension)：在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍

3、，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA扩增达106倍。　　（一）、PCR反应中的主要成份　　1、引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1)引物长度约为16～30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。(2)引物中G+C含量通常为40%～60%，可按下式粗略估计引物的解链温度Tm＝4(G+C)+2(A+T)。(4)引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对

4、应，以减少由于密码子摆动产生的不配对。(6)两引物之间尤其在3'端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量。(7)引物5'端对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。通常应在5'端限制酶位点外再加1～2个保护碱基。(8)引物不与模板结合位点以外的序列互补。一般PCR反应中的引物终浓度为0.2～1.0μmoL/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低则降低产量。　　2、4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：dNTP应用NaOH将pH调至7.0，并用分光光度计测定其准确浓度。dN

5、TP原液可配成5～10mmol/L并分装，-20℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20～200μmol/L。3、Mg2+：Mg2+浓度对TaqDNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+浓度范围为0.5～2mmol/L。对于一种新的PCR反应，可以用0.1～5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。164、模板：PCR反应必须以DNA为模板进行扩增，模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效

6、果稍好)。就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。一般反应中的模板数量为102～105个拷贝，对于单拷贝基因，这需要0.1μg的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA。扩增多拷贝序列时，用量更少。灵敏的PCR可从一个细胞，一根头发，一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列。模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。　　5、TaqDNA聚合酶：一般TaqDNA聚合酶活性半衰期为92.5℃130min，95℃40min，97℃5min。现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶，这些酶的活性在高温下活

7、性可维持更长时间。TaqDNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下，30min，掺入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量。TaqDNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一般PCR中出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环。在100μlPCR反应中，1.5～2单位的TaqDNA聚合酶就足以进行30轮循环。所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减。酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。　　6、反应缓冲液：反应缓冲液一般含10～50mmol/LTris·Cl(20℃下pH8.3～8.8)，50mmol/LKCl和适当浓度的Mg2+。Tris·