小鼠骨髓Thy1lowSca1Lin细胞分选及肝内移植向肝细胞分化的研究

《小鼠骨髓Thy1lowSca1Lin细胞分选及肝内移植向肝细胞分化的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、中山大学博士学位论文小鼠骨髓Thy-1<'low>Sca-1<'+>Lin<'->细胞分选及肝内移植向肝细胞分化的研究姓名：何劲松申请学位级别：博士专业：普通外科学指导教师：陈积圣2003.5.8中山大学博士学位论文中文摘要小鼠骨髓Thy．110wSea-1+Lin‘细胞分选及肝内移植向肝细胞分化的研究专业名称博士研究生指导老师普通外科学何劲松陈积圣教授摘要、、1帑阿辞槲目盹】，l近年来，肝细胞移植已成为治疗各种肝功能衰竭的一种新方法。移植后的肝细胞能够在异位组织中长期存活，并且在一定程度上发挥肝细胞的功能，少量移植的肝细胞通过体内增殖可以达到纠正先天性肝脏代谢障碍，暂时的肝功能支持以及受损肝

2、实质的替代等治疗目的。随着细胞生物学和发育生物学技术的进一步发展，肝细胞移植(HTx)技术日益展示出广阔的应用前景。但目前仍有许多问题需要解决：如肝细胞的来源短缺，移植细胞数量的限制，移植后肝细胞的增殖，受损肝实质的替代程度，肝功能支持的时间以及免疫排斥等诸多问题。虽然国内外在移植后肝细胞增殖等领域做了大量努力，效果仍欠理想，影响了临床应用。因此，寻找一种新的治疗方法成为当务之急。干细胞是胚胎细胞的天然增殖单位，也是成人细胞再生及各种组织再生的天然增殖单位，干细胞不仅具有很强的自身增殖能力，还具有向各种类型细胞分化的能力。干细胞移植不但可以替代受损的组织，还可以刺激受体组I／织增生以达到自身修

3、复舷年来，造血干细胞(HSCs)的可塑性研究取得了巨J大进展，HSCs移植后在体内能分化成具有白蛋白分泌功能的肝细胞，为肝细胞移植治疗肝疾病提供了新的供体来源。与成熟肝细胞相比，HSCs具备中山大学博士学位论文中文摘要较高的增殖能力及较低的免疫原性，作为肝细胞移植的供体来源有一定优势，并且避免了胚胎干细胞研究的伦理学争论，故临床应用前景非常突出。(移植细胞体内增殖问题一直是影响细胞疗法临床应用的关键，治疗性肝＼再生技术的发展，使少量细胞移植达到受体全肝细胞的替代，从而获得原位肝移植(OLT)M样的整体器官替代效果成为现实。倒千里光碱(RS)能抑制自身肝细胞增殖，为移植细胞制造有效的增殖空间，从

4、而使移植细胞达到功能性转化效果。HSCs没有明确的形态学特征，都表现为淋巴细胞样的单个核母细胞，Thy．110”Sca．1+Lin‘表型为HSCs共同抗原标志被广泛接受，利用免疫磁性分离方法(MACS)可望从骨髓细胞中分离出Thy一110”Sea一1+Lin‘细胞。在受体组织中鉴定移植细胞的来源(即供体细胞)一直是一个比较困扰的问题。荧光示踪剂CFDASE用于细胞追踪鉴定的方法日渐成熟，已被应用于肝细胞移植研究，但用于干细胞定向分化的研究少见报道。太’本试验将分离纯化并标记的同种小鼠骨髓造血干细胞Thy．110”Sca．1+Lift移植入倒千里光碱(Retrorsine)处理过的同种小鼠肝内，

5、观察移植细胞在肝内分布，分化状况及功能表达。以进一步获取造血干细胞Thy．110”Sea．1+Lin‘肝内移植治疗肝疾病的证据。l【材料和方法】＼1．小鼠骨髓造血干细胞分离和标记1．1MACS分离骨髓HSCs取6～8周BALB／c小鼠，利用HSCs抗原标记，采用MACS方法分离Thy-1“”Sca一1+Lin。细胞，流式细胞仪检测细胞纯度。1．2CFDASE标记HSCs绿色荧光蛋白CFDASE标记Thy—110”Sea．I+Lin。细胞，流式细胞仪检测标记率。2．同种肝内移植HSCs2．1倒千里光碱预处理受体鼠Ⅱ中山大学博士学位论文中文摘要‘——————————————————————————

6、————_●●______-__—____________-_____________—-______________-____________——--__________-—-一6～8周BALB／c小鼠，分两次腹腔注射Retrorsine，20mg／kg体重，间隔2周，第二次注射后2周行HSCs肝内移植，移植前直线加速器高能x线一次性照射小鼠，总剂量5．6Gy。2．2HSCs肝内移植经门静脉注射CFDASE标记的纯化HSCs，每只小鼠0．5ml，细胞总数约0．5～1×104。2．3荧光免疫组化检测白蛋白表达分别于HSCs移植后第1、2、4周取肝组织冰冻切片，4％甲醛固定，按试剂盒说明操作，共

7、焦显微镜下观察结果。2．4HSCs肝内增殖状况比较图像分析第1、2、4周各组移植细胞肝内面数密度，判断移植细胞肝内增殖状况。【结果】1．MACS分离Thy．110”Sca．1+Lin。细胞纯度为82．63％，CFDASE标记荧光明亮清晰，标记率为99．85％。2．两周后，四组受体小鼠肝组织中可见移植细胞表达白蛋白信号，四周后更明显。3．A组移植后第1、2、4周阳性细胞面数密度(Nv)比较没有显著差