小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为肝细胞及细胞移植对肝损伤作用的研究

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1、摘要小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为肝细胞及细胞移植对急性肝损伤作用的研究摘要肝脏是动物体内最大的腺体，也是最重要的器官之一，肝脏的功能极为复杂，有体内‘化学工厂’’之称，所以肝脏一旦发病就严重威胁人类的身体健康，也是人类因疾病死亡的主要原因之一．目前人们对于各种原因导致终末期肝病仍然没有有效的治疗措施，原位肝移植(orthotopiclivertransplantation，OLT)成为了疾病治疗最后的保障，然而由于肝脏供体来源的短缺和可能发生免疫排斥反应的限制，肝移植的应用比较局限。肝细胞移植技术(hepatoeytetmnSplmta

2、tion，HCT)是继原位肝移植技术后又一种治疗各种终末期危重肝病的方法，而且相对于OLT更具有优势，但同样也面临着细胞一来源的问题，而目前作为体外支持治疗用的生物人工肝(bioartificialliver，BAL)也因为肝细胞来源问题而进展缓慢，如何进一步解决肝细胞的来源、数量和活力问题成为了开展HCT治疗和BAL技术的核心问题。胚胎干细胞(Embryonicstemcells．ES细一胞)具有无限增殖和三胚层多向分化的潜能，是再生医学重要的种子细胞，为各种损伤及退行性疾病的细胞治疗带来了新的希望，建立有效的定向诱导分化技术用于损伤

3、和疾病组织的修复和替代治疗研究是目前ES细胞研究的重要方向。研究表明ES细胞可一以在体内外成功地分化为肝细胞，这对于各种终末期肝病的细胞治疗提供了潜在无限的细胞来源，然而Es细胞诱导分化肝细胞的研究还处于初级阶段，目前主要模拟肝脏发育的机制，通过相关细胞因子或化合物、基因修饰和共培养的方式诱导ES细胞分化为肝细胞，技术复杂、分化效率低下、成本高．本研究使用小鼠胚胎干细胞系ES．D3细胞作为研究对象，建立了两步法单层诱导Es细胞分化为肝样细胞的方法，并对诱导分化所得的肝样细胞从形态学、基因表达、蛋白分子标记及细胞功能等方面进行了检测，证明

4、了分化所得细胞为肝细胞，而且分化所得肝细胞脾脏移植到损伤小鼠肝脏后可以归巢并整合到小鼠损伤肝组织内；最后，利用建立的小鼠四氯化碳急性肝损伤模型，通过活体动物实验检测了人胎肝细胞系HL-7702作为生物人工肝细胞来源的潜力．本研究共分为六个部分，第一、二和三部分进行了小鼠胚胎干细胞系ES．D3细胞的培养和诱导分化，并从细胞的形态结构、基因表达、蛋白分子标记及细胞功能方面进行了全面检测，诱导分化所得细胞为肝样细胞；同时对诱导分化过程中，丁酸钠导小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为肝细胞及细胞移植对急性肝损伤作用的研究致的细胞凋亡现象和细胞周期分布进

5、行了研究，表明EGF可以抑制细胞凋亡．第四部分通过灌胃的方法，建立了小鼠急性四氯化碳肝损伤模型；第五部分将体外DAPI标记的分化所得的ES．D3．Hep细胞通过脾脏注射的方法，移植到急性肝损伤小鼠体内，表明移植的Es．D3．Hep细胞可以整合到损伤的肝组织内．第六部分利用建立的小鼠急性四氯化碳肝损伤模型，过腹腔移植人胎肝细胞HL．7702，表明其作为生物人工肝的细胞来源具有潜在的价值．主要的研究结果如下：第一部分在小鼠ES．D3细胞的培养及定向诱导分化为肝细胞的形态学观察试验中，以小鼠胚胎干细胞系mESC．D3为实验材料，应用KNOCK

6、OUT-DMEM和KNOCKOuT．sERL刀ⅥREPLACEM盼盯建立了小鼠Es细胞无血清培养的基础上，结合明胶铺被，初步建立了小鼠ES细胞无血清无饲养层的培养体系，通过比较差速贴壁结合传代和单纯传代对去除饲养层细胞MEF的效果，结果表明，差速贴壁结合传代去除饲养层细胞MEF的效果好于单纯传代，为Es细胞后续诱导分化奠定了基础．同时，mESC．D3细胞通过两阶段单层诱导分化培养共19天，逐渐分化为肝样细胞，光镜和透射电镜对分化细胞形态结构和超微结构的观察表明，分化所得细胞具有肝细胞的形态结构特征．第二部分对Es．D3细胞诱导分化所得的

7、Es．D3．Hep细胞的一些标志基因的表达进行了检测，同时对第一阶段诱导分化过程中诱导分化剂丁酸钠产生的细胞凋亡和细胞周期分布进行了检测．结果表明，分化所得的Es．D3．Hep细胞表达肝细胞具有的标志基因AFP、ALB、’rnt和丸盯，而自发分化组细胞只是微弱表达AFP和ALB，不表达肝细胞晚期标志物邢己和AA：r，提示诱导分化所得的ES．D3．Hep细胞已经具备肝细胞具有的基因表达特征，包含不同成熟阶段的肝细胞．诱导分化7天，NaB引起细胞凋亡使大量细胞的细胞周期阻滞在S期，而通过添加EGF，可以明显降低S期细胞周期的比例，增加Go／

8、Gl期细胞的比例，抑制细胞凋亡．第三部分对ES．D3细胞分化所得的ES．D3．Hep细胞进行了相关重要标志蛋白的免疫荧光分析，同时对其肝细胞功能进行了鉴定．结果显示，ES．D3．Hep细胞表达肝细胞特异性标