山药多糖抗缺氧复氧诱导的胚鼠大脑皮层原代神经细胞凋亡研究

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1、学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得直昌太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签签字日期：函厂多年易月7日权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，

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3、，为中药多糖的开发和利用提供实验依据。方法：l、胚鼠大脑皮层神经细胞无血清培养。2、胚鼠大脑皮层神经细胞无血清缺氧／复氧培养。3、MTT法检测不同剂量的山药多糖对正常和缺氧／复氧培养的胚鼠大脑皮层神经细胞的刺激和毒性作用。4、实验分组：(1)正常对照组(Con．)：原代培养的神经细胞在37℃、5．0％饱和湿度C02培养箱中连续培养6d；(2)阳性对照(凋亡诱导)组(Apo．)：原代培养的神经细胞在37℃、5．0％饱和湿度二氧化碳培养箱中培养4d后再缺氧培养12h复氧培养24h培养；(3)山药多糖干预组(CYPS)：原代培养的神经细胞在37。C、5．0％饱和湿度C02培养箱中培养

4、4d后，分别加入终浓度为O．0259／L(CYPSi组)、0．059／L(CYPS2组)、O．19／L(CYPS3组)、0．259／L(CYPS4)山药多糖预处理4h后再缺氧培养12h复氧培养48h。5、AnnexinV-FITC／PI荧光双染流式细胞仪测定实验各组神经细胞早期凋亡率、晚期凋亡率及坏死率。6、Hoechst33342荧光染色观察实验各组神经细胞凋亡形态变化及实验各组的细胞凋亡率。7、流式罗丹明．123(Rh一123)荧光染色检测实验各组神经细胞内线粒体损伤情况。8、核DNA琼脂糖凝胶电泳检测实验各组神经细胞凋亡晚期核DNA降解情况。9、RT-PCR半定量法检测实

5、验各组神经细胞内Caspase．3、Bax和Bcl．2mRNA的相对表达。摘要10、免疫细胞化学染色检测细胞NSE及GFAP阳性表达率，鉴定培养的神经细胞，以及实验各组神经细胞内Bcl一2、Bax和Caspase．3蛋白的阳性表达率。结果：l、体外培养6d的SD胚鼠大脑皮层神经细胞经抗NSE、GFAP抗体免疫细胞化学染色显示，细胞NSE阳性率为(93．7±0．56)％，而GFAP阳性表达率仅为(8．78±0．55)％。2、MTT法测定体外常氧培养的SD胚鼠大脑皮层神经细胞发现，山药多糖在0．05∥L～O．59／L的浓度范围内神经细胞生长活性较对照组显著升高(P<0．05)，在1

6、．Og／L～4．Og／L的浓度范围内对神经细胞活性无显著影响(p0．05)，而当山药多糖浓度为8．09／L时对神经细胞生长有明显地抑制作用(P<0．05)。3、MTT法测定经山药多糖预处理后缺氧／复氧培养的SD胚鼠大脑皮层神经细胞发现，各实验组较常氧培养正常对照组神经细胞生长活性明显降低(P<0．05)，但山药多糖浓度在0．059／L～0．1∥L时显著地抑制缺氧／复氧诱导的神经细胞损伤(P<0．05)，而在0．025g／L和0．259／L～1．Og／L之问对缺氧／复氧诱导的神经细胞损伤也有一定的保护作用，2．0g／L加重缺氧／复氧诱导的神经细胞损伤并与凋亡阳性组相同。4、Hoc

7、hest33342荧光染色法分析经山药多糖预处理后缺氧／复氧培养的SD胚鼠大脑皮层神经细胞发现，山药多糖在0．025g／L～0．259／L各组凋亡率分别为(32．08±1．64)％、(26．74±O．45)％、(22．32±1．81)％、(28．54±0．79)％，均较凋亡阳性组(37．61±2．87)％明显下降(尸<0．05)，且较正常对照组(6．48±O．55)％凋亡率显著升高(P<0．05)。5、流式AnnexinV-FITC／PI荧光双染法分析经山药多糖预处理后缺氧／复氧培养的SD胚