血管内皮生长因子在急性白血病中表达的研究

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1、中国医科大学硕士学位论文血管内皮生长因子在急性白血病中表达的研究姓名：崔华东申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：何娟20030301中文摘要前言／血管新生在实体肿瘤的生长、浸润及转移的过程中起着至关重要韵作用。最近发现血液系统恶性肿瘤中也存在血管新生现象，如急性非淋巴细胞性白血病(Acutemyeloidleukemia，AML)、急性淋巴细胞性白血病(AcutelymphocyticleuI【emia，ALL)、多发性骨髓瘤(Multiplemyeloma，MM)等。血管内皮生长因子(VasculaLrendotheliumgrowthfactor，VEGF)是最重要的促进血管生

2、成的因子之一，具有增加血管通透性、促进内皮细胞移行和增殖等作用。一个体外细胞培养实验证实一些恶性血液病细胞系表达VEGF及其受体，Fiedhr等还发现初诊AML患者外周血或骨髓单个核细胞VEGF表达量比正常骨髓细胞及富含CD34+细胞明显高毋本实验应用免疫细胞化学及流式细胞术的方法检测了初诊急佳白血病患者骨髓或外周血单个核细胞VEGF蛋白的表达情况，以明确急性白血病细胞是否高表达VEGF，以及VEGF在急性白血病发病过程中是否起重要作用。，／材料和方法L、一、临床资料初诊急性白血病患者59例，其中AML31例，ALL28例，诊断符合FAB标准。平均年龄40．5(15-75)岁。以14例

3、骨髓正常者做对照组。二、外周血或骨髓单个核细胞分离3—5ml肝素抗凝的外周血或骨髓，应用密度梯度离心法分离单个核细胞，所得细胞中白血病细胞比例大于90％。三、免疫细胞化学方法检测VEGF表达．1·离心涂片枧作缨照涂片，～∞℃保存，采用SAP方法检测。保存的缨胞涂片玲孬嗣鼹定lO分钟，如羊盘漶室湿封闭30分钟，然麓加入∞心兔抗人V嚣GF多抗(1：100)37℃孵育2小时，再依次鸯鼙入生物素亿羊撬兔二抗翻SAP复合物37℃孵育30分铮，坚固红显色5一10分钟，苏本素复染2分钟。以PBS代替一撬终熙性对照。光学显微镜下观察计数帑性纲骢数。纲胞浆染成淡粉色至深蕴色酶秀鼯性缨艟，阳性缨施数大手∞

4、％判定势疆性。西、流式缵稳米方法检测VEGF表达量对其中30铡白斑病标本和9镶对照组标本应耀流式细憨术方法检测VEGF豹表达量。分离酶单个棱缨胞，70％冷乙醇匿定，一20℃保存。检测时4℃离心弃乙醇，PBS洗两次，l％小牛盘渍封闭弼分锌，加入兔抗入VEGF多抗(终浓度l：100)塞温孵寅2小时，PBS洗两次后褥加入疆％标记的羊抗兔二扰(终浓度1：100)室温避光孵育30分事＆PBS洗两次，重新悬浮缅脆，上槐检测。以PBS代替一抗作阴性对照。以平均荧光强度(Meanfluo-l'e$ceIlCeintensity，MFI)表示VEGF的表达量：MFI=加一抗细胞的荧光强度一阴性对照纲耱的

5、荧光强度。五、流式细脆术进行细施髑期分析70％冷乙醇固定的细胞4。C离心弃乙醇，PBS洗两次；掇入l础含RNA酶(200“∥蕊)的PBS，37℃孵育30分钟，离心弃RNA酶，冷PBS浼两次；加入含碘化丙啶(终浓度10p∥蕊)的PBS0．5m1．4℃避光染色30分钟；离心弃染液，PBS羹新悬浮细胞，上槐检测。以增殖指数(Proliferationindex，PU表示细脆的增殪状态：～(G2M十S)细胞数“一(G∽+G2鹾+S)细脆数六、统计：应用SPSS统计分祈软件，两缀闻率的院较精#检验，MFI的比较用秩和检验，MFI经对数转换后带一元线性舀j

6、{j法分析其与PI之间的相关性。·2·结

7、果一、免疫细胞化学59例初诊急性白血病患者中有31例VEGF呈阳性表达，阳性率为52．5％(31／59)，而正常对照组阳性率为14．3％(2／14)，二者相比具有显著差异，x2=6．686，P<0．01。3l例AML患者中有21例呈阳性表达，阳性率为67．7％(21／31)，显著高于ALL组的阳性率(35。7％，10／28)，)(2=6。052，P<0．05。二、流式细胞术30例急性白血病患者的VEGFMFI(中位数：2．405；均值：4．075；P25一P75：0。553—4。965)显著高于9例正常对照组标本的MFI(中位数：0．000；均值：0．654；‰一P75：O．000—0

8、．865)，z=3．113，P