寡核苷酸芯片技术杂交条件优化研究

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1、山东省医学科学院硕士学位论文寡核苷酸芯片技术杂交条件优化研究姓名：潘继红申请学位级别：硕士专业：微生物与生化药学指导教师：韩金祥200305012003届硕士研究生学位论文寡核苷酸芯片技术杂交条件优化研究摘要基因芯片是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项新技术。它具有高通量、微型化、自动化和高度平行的特点，在许多领域有广泛的应用。该技术主要包括四个部分：DNA微阵列的制备、样品制备与标记、分子杂交与扫描、生物信息学分析。寡核苷酸芯片是根据反向杂交的原理，把事先设计并合成好的十几至几十个碱基的寡核苷酸探针通过点样仪固定到玻片上，与荧光标记的靶序

2、列在一定条件下杂交，经洗涤后扫描检测信息。杂交是芯片技术中最重要的一个环节。寡核苷酸芯片的杂交过程受许多因素的影响，如探针长度、空间位阻、靶序列长度、杂交温度等。这些因素的影响是造成目前寡核苷酸芯片杂交重复性差的主要原因。重复性的好坏是寡核苷酸芯片应用中人们所关注的重要问题。由于探针是通过共价键一端固定于玻片表面，杂交时只有标记的靶序列可以自由移动寻找互补的探针并与之杂交，因此靶序列和探针的结合有一定的空间位阻。为减少空间位阻，使杂交更易进行，通常的方法是在探针的5’端连上一定长度的臂作为spacer。Spacer的长度不同、探针的长度不同以及不

3、同大小的靶序列，杂交时的空间位阻有很大的区别，对杂交信号强度影响很大。因此为获得灵敏、快速、重复性好的杂交结果，我们对杂交条件进行了优化，探讨了不同spacer长度、探针长度、靶序列长度对杂交信号和芯片杂交重复性的影响，优化了杂交温度和杂交时间。探讨了由空白玻片自己处理成氨基玻片和醛基玻片的方法，以及采用PcR方法制各长探针进行较长靶序列杂交检测的方法。目的t探讨寡核苷酸芯片探针固定化的方法，研究寡核苷酸芯片的重复性与Spacer和探针长度之间的相关性，优化杂交条件。探讨由空白玻片自己处理成氨基玻片和醛基玻片的方法，以及采用PcR方法制备探针进行

4、长片段靶序列杂交检测的方法。方法：设计spacer为poly(dT)Io～20的长度为15～30的探针，与122～1067bp的荧光标记靶序列杂交，杂交温度选择42～65℃，杂交时间选择1～3h。第l页2003届硕士研究生学位论文寡核廿睃芯J{技术杂交条件优化研究扫描分析杂交结果，通过Quantam．y定量分析软件进行定量。由空白玻片自己处理成氨基玻片和醛基玻片：PCR方法制备探针与长片段靶序列进行杂交检测。结果：较短的如100bp左右的靶序列，spacer为p01y(dT)10、探针为20mer左右即可获得非常理想的杂交结果。较长的如750bp

5、左右的靶序列，较短的spacer不能获得理想的杂交结果，可以选择poly(dT)15或poly(dT)20。探针应为20mer以上，25mer和30mer均能获得较好的杂交结果。1k以上的靶序列与15～30mer的探针杂交信号较弱。随探针长度的延长，杂交信号的变异系数逐步降低。15mer的探针杂交的信号较弱，杂交不够稳定，重复性也相对较差。20mer、25mer、30mer的探针的变异系数逐渐降低。spacer为15时变异系数最小。用由空白玻片处理得到的氨基玻片和醛基玻片可以获得良好的杂交信号。PcR方法制备的长探针与lk左右的长靶序列有良好的杂

6、交结果。结论：通过优化杂交条件可以有效地提高杂交效率。选择spacer为poly(dT)15的25mer和30mer的探针可以获得较好的重复性。由空白玻片处理得到的氨基玻片和醛基玻片可以代替购买的氨基玻片用于实验，可以获得理想的检测结果，且成本低廉。对于500bp以下的较短的靶序列可以采用带有较短的spacer如poly(dT)10～15和较短的如20～25mer探针即可获得理想的杂交结果。而对于较长的如750bp左右的靶序列，spacer为poly(dDl5探针长度为25～30mer亦可获得理想的杂交结果。对于lk左右的靶序列，采用短探针难以获

7、得理想的稳定的杂交结果，采用PcR方法制备的长探针可以获得较好的杂交结果。第2页2003届硕士研究生学位论文寡核廿艟芯片技术杂交条件优化I{】f究AbstractBiochipisamicronuidicsystemforbiologicalanalysis，whichhasbeendeVelopedrapidlyinthefieldoflifescienceinrecentyears，ThegeDechjphasthecharacteristicofhighmroughput，minjature，automaticandh逗hlyparalle

8、landwecanfinditsapplicationinmanyfields．111istechn0109yismadeupoffou