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时间:2018-11-11
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1、斑点杂交条件的建立及优化【摘要】目的进行斑点杂交条件的建立及优化。方法采用带正电荷的尼龙膜对斑点杂交的每一步骤进行优化,包括预杂交液,杂交液,洗涤和封闭液等及各步反应时间,并采用最终确立的条件检测糖基转移酶基因多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(pp-GalNAcT2)在K562、NB4、NIH3T3和SGC7901细胞株中的差异表达以验证膜杂交条件的可行性。结果建立并优化了膜斑点杂交的条件,本底清晰,结果可靠。结论建立的斑点杂交技术经济简便,切实可行。【关键词】斑点杂交;糖基转移酶;基因Theestablishmentandopti
2、mizationofthedotblotprerequisite【Abstract】ObjectiveToestablishandoptimizethedotblottechnique.Methods13正向、反向引物进行克隆PCR,M13ForM的EDTA对比稀释,使成0.4NNaOH和10mM的EDTA的终浓度。(2)把稀释的pp-GalNAcT2的cDNA片段在100℃变性5min,迅速置冰,冰冷10min以上。(3)膜(购自Amersco公司,带正电荷)用灭菌双蒸水浸泡10min,悬空晾干。(4)每点2μl把pp-GalNA
3、cT2的cDNA片段点在尼龙膜上,湿膜在紫外灯下照2min,取出让膜干燥。(5)杂交时以2×SSC浸膜5min,装入杂交袋,根据VECTORNIT软件计算杂交温度的方法确定杂交温度为42℃。以每100cm2膜加20ml的预杂交液(50%的去离子甲酰胺,5×SSC,0.1%SDS,0.1%BSA,0.1%PVP,用pH7.5的PB调终体积)于42℃预杂交2~3h。(6)弃去预杂交液,在杂交液(50%的去离子甲酰胺,5×SSC,0.1%SDS,0.1%BSA,0.1%PVP,10%的硫酸葡聚糖,100μg/ml的剪切的鲑鱼精DNA,用水
4、调终体积)中加入适量探针,以每100cm2膜加10ml的杂交液于42℃杂交过夜。(7)用足量洗涤液1(2×SSC,0.1%SDS)于42℃洗涤2次,再用洗涤液2(0.5×SSC,0.1%SDS)于55℃严谨洗涤2次。(8)用蒸馏水淋洗膜2~5min,然后用封闭液(不同浓度的BSA,0.1MNaCl,0.2%Triton-100,0.1MTris,pH7.5)封闭。(9)倒出封闭液,加入用封闭液配制的适当比例稀释的卵白素-碱性磷酸酶(购自上海华舜生物工程有限公司),37℃孵育30min。(10)洗涤液3(0.1MTris,0.15MN
5、aCl,0.3%Tl检测缓冲液加66μlNBT和11μlBCIP(均购自上海华舜生物工程有限公司)的显色液显色。(11)显色结束后以TE终止,用扫描仪获取图像。1.2.2斑点杂交建立及优化程序(1)尼龙膜上不点任何样品,以下述条件行假杂交反应。杂交液中探针的终浓度为:200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml;酶的稀释比例为:1/400、1/800、1/2000、1/5000;封闭液中BSA的终浓度为:2%,封闭2h;杂交后洗涤液1和2分别洗2次,每次1h;封闭后洗涤液洗2次,每次1h;检测缓冲液平衡1h;显
6、色30min。(2)以(1)所获得的最佳本底,在尼龙膜上点上pp-GalNAcT2的cDNA片段,其余条件不变,封闭液中BSA的浓度设计成2%、3%和5%三梯度进行杂交反应(3)以(2)所获得的最佳条件,改进以下条件:①杂交后洗涤时间每次1h;每次30min;每次10min;②封闭液封闭时间2h;1.5h;50min;③封闭后洗涤时间由每次1h;每次40min;每次20min;④检测缓冲液平衡时间由1h;30min;10min;⑤显色以出现清晰的阳性信号,本底最低为尺度,一般在15min左右,时间延长本底升高。1.3斑点杂交法检测K
7、562、NB4、NIH3T3和SGC7901细胞株pp-GalNAcT2的表达差异NIH3T3成纤维细胞、胃癌细胞株SGC-7109、白血病细胞株K562和NB4购自上海生化细胞所;RNA抽提试剂TRIZOL、PCR试剂盒、pUCMixDNAmarker和ladder购自Invitrogen公司,六随机引物购自Takara公司。实验所用pp-GalNAcT2和β微球蛋白(内对照)引物采用Geyx软件设计,并经GenBankBlast同源检索后由上海生工生物技术公司合成。β-MG引物序列为:F:5′-CTCGTGCTACTCTCTCT
8、TTC-3′R:5′-CATGTCTCGATCCCACTTAAC-3′预期扩增产物长度330bp。ppGalNAc-T2引物为:F:5′-GAAAGAATTAGGAAGGGTCAGAAC-3′R:5′-CTGTGTCAATGTAAAC
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