正文描述:《应用寡核苷酸芯片进行hla》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、应用寡核苷酸芯片进行HLA作者:王彤,王天骄,何群,张玉魁,马佳明,侯伟建,王绍成,潘忠诚,赵雨杰【摘要】为了构建HLA-DQA1位点寡核苷酸分型芯片并籍此建立一种应用于HLA系统基因分型的集成化技术平台,在多态性集中的HLA-DQA1第二外显子区域,自行设计一套寡核苷酸分型探针;采用本实验室自建的方法,制成寡核苷酸芯片。提取的基因组DNA以组间特异性引物,单侧引物荧光标记,行不对称扩增。杂交后扫描检测分析杂交信号,确定HLA等位基因型;分型结果以标准DNA和PCR产物测序检测。结果表明:100例样本芯片分型全部成功,其中50例标准DNA与其模板相符,另50例临床样本
2、中随机选取的10例与其测序结果相符,其中2例分型结果不完全;重复杂交实验中,位点重现率95%。结论:研制的HLA-DQA1等位基因分型芯片,其准确性和重现性理想,且操作简便、快捷,有广泛的应用前景。【关键词】基因分型 HLA-DQA1GenotypingbyUsingOligonucleotideMicroarrays AbstractInordertofabricatetheHLA-DQA1genotypingchipanddevelopanintegrated,paralleltechnicalplatformtotypeHLAsystem,apairofpr
3、imersandasetofprobesorphismisconcentrated.Theoligonucleotidechipadeethodsdevelopedinourlaboratory.ThetargetDNAmetricallyamplifieder.ThesignalsicroarrayandPCRproduct.Thealleletypesofthesamplesplesand50clinicalsamples.Amongthem,resultsofthe50standardDNAsamplesmatchedthEirtemplates.Intheot
4、her50samples,resultsoftherandomlyselected10matchedthEIrsequencingresultsexceptthattgottheinpletelyresult.Inreproducibletests,thesignalreappearrateissimpleandconvenienticroarrays),对HLA-DQA1位点进行基因分型检测,旨在建立一套成熟的分型技术,用于复杂的HLA系统的分型研究。 材料和方法 DNA样本 50例临床样本采自中国医科大学附属第一医院,50例标准DNA样品由中国刑警学院法医系
5、法医学教研室提供[7]。 主要试剂及仪器 手臂分子氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)(Sigma公司),PCR试剂盒及相关试剂(Promega公司),鲑鱼精DNA(Sigma公司),其他化学试剂均为分析纯。PCR扩增仪(BiometraPersonalPCRsystem,USA),生物芯片点样仪(MGⅡ600,BioRobotics,England),激光共聚焦扫描仪(GeneTACTMLSIV,GenomicSolutionsInc.USA) 引物及探针 根据GenBank数据库新近公布的HLA-DQA1等位基因序列,在多态性集中的exon2保守区及变异区分
6、别设计1对引物及16条特异性分型探针,交由上海生物工程公司合成,并在正义链引物5’端作FITC标记,序列如下:P1(+)Exon2:5’-TGTATTACATGGGAATATGTGATTTTAGA-3’;P2(-)Exon2:5’-CAGGGGTTGGAAATGTCCAC-3’,并在各探针5’端做氨基修饰。各组探针的序列见附表。 全血基因组DNA的提取 改良的酚/氯仿法:1ml抗凝的外周血,896×g离心5分钟,分离中层白细胞后,传统酚/氯仿/异丙醇法[8]抽提DNA,-20℃保存。 PCR扩增与产物标记 扩增体系20μl,含基因组DNA1μl。以组间特异性引
7、物,行1∶20不对称扩增。扩增条件96℃5分钟,96℃30秒,59℃40秒,72℃40秒,35个循环。产物以聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测。 载片制备 本室自建流程。市售玻片(20mm×20mm)于铬酸溶液中浸泡12小时以上,蒸馏水洗净,1NNaOH浸泡1小时,丙酮化3分钟。浸入手臂分子溶液(2%氨基丙基三乙氧基硅烷,以95%丙酮溶解)10分钟,丙酮清洗,104℃烤干后,5%戊二醛中浸泡过夜。 寡核苷酸微阵列的制备 以预先摸索好的条件,将16条寡核苷酸探针以探针缓冲液重悬至80μmol/L,与同等浓度的阳性对照探针(全序列匹配的反义链引物
显示全部收起
温馨提示:
1. 部分包含数学公式或PPT动画的文件,查看预览时可能会显示错乱或异常,文件下载后无此问题,请放心下载。
2. 本文档由用户上传,版权归属用户,天天文库负责整理代发布。如果您对本文档版权有争议请及时联系客服。
3. 下载前请仔细阅读文档内容,确认文档内容符合您的需求后进行下载,若出现内容与标题不符可向本站投诉处理。
4. 下载文档时可能由于网络波动等原因无法下载或下载错误,付费完成后未能成功下载的用户请联系客服处理。