超嗜热古菌ThermococcussiculiHJ21产高温α葡萄糖苷酶的研究

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1、摘要摘要a．葡萄糖苷酶(a．glucosidase，EC3．2．1．20)又称麦芽糖酶(maltase)和a一转移葡萄糖苷酶(a-transglucosidase，EC2．4．1．24)，可以从低聚糖类底物的非还原性末端切开a-1，4糖苷键，释放出葡萄糖，或将游离出的葡萄糖残基以a．1，6糖苷键转移到另一个底物上，从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖(蹦O)、糖脂或糖肽等。a．葡萄糖苷酶在淀粉加工工业中可以用作糖化酶制剂，与静淀粉酶一起生产高葡萄糖浆。另外，a．葡萄糖苷酶作为工业化生产IMO的关键酶制剂备受国内外食品工业界的

2、重视。目前，工业生产中使用的a．葡萄糖苷酶主要来源于黑曲霉(Aspergillusniger)。对一株分离自深海热液口的超嗜热古菌(ThermococcussiculiHJ21)菌株进行了产弘葡萄糖苷酶条件的优化和酶学性质的初步研究。胞内发酵时间为6h，胞外发酵时间为21h时，较适合产a．葡萄糖苷酶；其最适产酶温度为85℃，pH为6．5，NaCl浓度为2．5％；可溶性淀粉、酵母粉和蛋白胨促进产酶。该洳葡萄糖苷酶的最适作用温度为100℃，90℃半衰期为2h；最适酶作用pH值为7．O，在pH为5．0～8．O之间酶活力相对稳

3、定；该酶热稳定性不依赖Ca：2+，且Ca2+对该酶有抑制作用，金属离子Cu2+、舢”、Ni2+对该酶有较明显抑制作用，H矿强烈抑制该酶的活性，而EDTA、Fe"和K+对该酶有激活作用。以Zsiculi脚21染色体DNA为模板，采用PCR技术，成功克隆了ZsiculiI-IJ21的a．葡萄糖苷酶基因。基因序列结果显示，该基因开放阅读框大小为729bp，编码的蛋白质分子含有242个氨基酸残基，分子量约27．2kDa。同Genbank数据库中已公开的0【．葡萄糖苷酶基因序列进行同源性比对分析结果表明，ZsiculiHJ21的

4、a．葡萄糖苷酶的基因序列与Thermococcushydrothermal括的0【．葡萄糖苷酶亲缘关系最近，同源性达到81％，氨基酸同源性达90％。关键词：超嗜热古菌；ThermococcussiculiHJ21；高温酶；a．葡萄糖苷酶AbstractAlpha-glucosidase(EC3．2．1，20)，alsonamedc【-transglueosidaseandmaltase，couldcatalyzetheliberationofa—D—glucosefromthenon-reducingendofpoly

5、-andoligo—saccharides．Italsocatalysestransglucosidationreactiontosynthesisisomerizedoligosaccharides．Alpha-glucosidasewasgenerallyinvolvedinthelaststepofstarchdegradation．ItWasusedtoproducehi曲glucosesyrupandiso—maltooligosaccharidewithCt-amylaseintheindustrialst

6、archprocessing．Atpresent，mostofa-glucosidaseusedinindustryWasfromAspergillusniger．ThecultureconditionforCt-glucosidaseproduction、玩n1ThermococcussiculiHJ21Wasoptimizedandthecharactersofcrudec【一glucosidasefromZsiculiHJ21werestudied．Theoptimalculturetimeforintracel

7、lularandextracellulara-glucosidaseproductionWasaround6hand27hrespectively．Theoptimaltemperature，pHandNaClconcentrationfora—glucosidaseproductionwere85℃，6．5and2．5％，respectively．Additionofsolublestarch,yeastextractandpeptonetothefermentationmediaenhancedenzymeprod

8、uction．Theoptimumtemperatureforenzymereactionwas100℃，andtheenzymeexhibitedextremethermostability，withahalf-lifeof2hat90℃．Thea-glucosidaseexhibitedmaximumactivityatpH7