芝麻香型白酒高温大曲嗜热功能菌的筛选与鉴定.pdf

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1、FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES芝麻香型白酒高温大曲嗜热功能菌的筛选与鉴定姚粟，张明娟，刘勇，信春晖，许玲。，张柏林，程池1(北京林业大学生物科学与技术学院，北京，100083)2(中国食品发酵工研究院中国工业微生轫菌种傈藏菅趟中‘心，北京，100027)3(山东扳倒井股份有限公司，山东高青，256300)摘要以芝麻香型白酒高温大曲为材料，采用55℃高温分离培养，通过平板透明圈法初筛和三角瓶固态发酵物蛋白酶活力测定复筛，分离筛选嗜热功能细菌，并结合16SrRNA基因序列分析和系统发育分析进行菌株鉴定。结果表明，55℃条件下共分离获得85

2、株嗜热细菌，其中M5中性蛋白酶活力为96．06U／g，优于对照菌株。菌株M5经分子生物学鉴定为枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillussubtilissubsp．Subtilis)，该菌株可制成微生物强化菌剂，应用于芝麻香型白酒的高温制曲过程中。关键词芝麻香型白酒，高温大曲，中性蛋白酶，筛选，鉴定芝麻香型白酒是我国传统白酒的重要创新香型十分重要的意义。之一，其融合了浓香、酱香、清香型白酒的特点，并以本研究在此基础上，通过可培养方法从芝麻香型优雅的芝麻香味而闻名，受到广大消费者青睐⋯。白酒高温大曲中筛选高温细菌，并测定其蛋白酶活高温制曲是芝麻香型白酒生产中重要的特点

3、，在制曲性，对其进行形态特征观察和分子生物学鉴定，为芝过程中最高温度可达到65℃，独特的高温环境富集麻香型白酒酿造过程中的微生物强化提供菌种资源，了大量嗜热菌，研究发现，嗜热芽孢杆菌能够代同时为芝麻香型白酒产香机理研究提供微生物学基谢2，3．丁二醇生成4．甲基吡嗪等芝麻香微量香味物础。质，且能够产生多种蛋白水解酶，为美拉德反应提供1材料和方法多种氨基酸，进而推动美拉德反应的进行，生成芝麻香香味成份及其前体物质，因此嗜热菌对芝麻香型白1．1实验材料酒的酒质有着重要的贡献。施安辉等采用传统1．1．1样品分离培养方法对徐坊芝麻香型白酒大曲的微生物的芝麻香型白酒高温大曲

4、曲块：由山东扳倒井酒厂分布进行了分析，发现芽孢杆菌属(Bacillussp．)为高提供。温大曲中优势菌属，徐泽江利用DGGE(变性梯度1．1．2菌株凝胶电泳)技术对芝麻香型白酒高温大曲细菌群落对照菌株：从浓香型酒曲中分离的1株地衣芽孢结构进行研究，发现高温大曲细菌群落结构由高温放杆菌。线菌属(Thermoactinomycessp．)和乳酸杆菌属(Lacto—1．1．3培养基bacillussp．)等6个菌属构成。曹建全等利用高温分离筛选培养基：成品R2A固态培养基。大曲和芝麻香老窖池中选育出的5株产酶能力较好生长保藏培养基：成品NA固体培养基。的嗜热芽孢杆菌制

5、作麸曲，发现麸曲质量好，能很好蛋白酶初筛培养基：脱脂奶粉1．5％，琼脂地提高芝麻香型白酒产品质量，使酒体更加丰满醇1．5％。厚，芝麻香更优雅。芝麻香型白酒高温大曲中蕴含有蛋白酶复筛培养基：15g麸皮，15mL蒸馏水。丰富的嗜热细菌菌种资源，并且这些菌种与芝麻香型1．1．4试剂白酒酒质有密切关系。因此，从高温大曲中筛选获得干酪素，北京奥博星生物技术有限责任公司；结嗜热功能菌，为白酒酿造提供优良的菌种资源，具有晶紫染液，北京陆桥技术有限责任公司；福林试剂，北第一作者：硕士，高级工程师(张柏林和程池教授为通讯作者)。京索莱宝科技有限公司；TaqDNA聚合酶、dNTP、

6、DL国家科技支撑计划课题(2012BAK17B11)2000Marker、100bpMarker，天根生物有限公司；Gold—收稿日期：2013—04—02，改回日期：2013—06—08View，北京塞百盛基因技术有限公司；溶菌酶，Sigma18『里!!：!：!!!191!公司、蛋白酶K，Merk公司；细菌基因组DNA提取试16SrRNA基因进行扩增。引物序列为：正向引物27f剂盒，天根公司。其余试剂均购自北京化工厂。(5．AGAGTTTGATCCTGGCTCA一3)，反向引物1492r1．2实验方法(5．GGTTACCTTGTTACGACTT一3)0。。1．

7、2．1嗜热菌株筛选50LPCR反应体系为：50ngDNA模板，1X无菌条件下取芝麻香型白酒高温大曲样品约10Taqreactionbuffer，引物各20pmol，20mo1dNTP，g放入研钵中，将样品研磨分散后，准确称取10g磨1．5单位Taq酶(Ferments)。反应程序为：95℃预变过的样品放入已灭菌的三角瓶中，摇匀，制成10稀性5min，94~C变性30S，50℃复性40S，72℃延伸释液；将三角瓶放人摇床振荡30min(37~C，200r／80s，35个循环后72℃延伸10min。PCR扩增产物用min)；振荡后，取出静止1h；依次稀释成10～、1

8、0～、1％的琼脂糖进行检