嗜热β-葡萄糖苷酶重组表达及纤维二糖水解特征研究

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1、嗜热p．葡萄糖苷酶重组表达及纤维二糖水解特征研究Expressingandcharacterizingathermophilic[i-glucosidaseforcellobiosehydrolysis姓2014年6月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果，也不包含为获得江苏大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明

2、。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：专长V潞k护tT,年6月ff日学位论文版权使用授权书江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致，允许论文被查阅和借阅，同时授权中国科学技术信息研究所将本论文编入《中国学位论文全文数据库》并向社会提供查询，授权中国学术期刊(光盘版)电子杂志社将本论文编入《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》并向社会提

3、供查询。论文的公布(包括刊登)授权江苏大学研究生处办理。本学位论文属于不保密西。学位论文作者签名：拟锄≯f舻年6月¨日指导教师签名：勿鲫．』勿，t侔Z月，／日江苏大学硕士学位论文嗜热B．葡萄糖苷酶重组表达及纤维二糖水解特征研究摘要：生物质能源作为新型的可再生能源，其发展对于缓解化石能源枯竭危机、减少日益严重的环境污染具有极其重要的意义。将纤维素类生物质转化为乙醇等其他能源产品是生物质能源发展的一个重要研究方向。但是，木质纤维素的高效转化利用仍然面临着很多挑战，其中一个重要问题是生物转化过程中所需纤维素酶的生产成本太高。

4、通过基因工程手段，获得性能较佳的产业化纤维素酶可以显著降低纤维素乙醇的生产成本。我们知道，6一葡萄糖苷酶是纤维素酶系的限速酶，它决定着纤维素酶整体活力的高低；与温和型B．葡萄糖苷酶相比，嗜热型在工业应用中具有明显的产业化应用优势。然而，产嗜热B．葡萄糖苷酶的极端微生物生长所需的条件一般难以达到，所以，目前通过采用基因工程手段，实现异源表达嗜热p一葡萄糖苷酶已成为各国的研究热点之一。激烈火球菌(毋阳cD∞姗．屈riosus)作为绝对厌氧的极端嗜热微生物，其产生的B一葡萄糖苷酶可能是目前热稳定性和酶活最好的B一糖苷键水解酶

5、之一。因此，本研究利用大肠杆菌EcoliRosetta重组表达该嗜热p．葡萄糖苷酶基因，激烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)嗜热p一葡萄糖苷酶基因的成功表达及其活性包涵体的成功发现，对于推进木质纤维素的高效生物转化及酶制剂工业化生产将具有重要意义。主要研究结果归纳如下：1)本论文以Pyrococcusfuriosus的基因组DNA为模板，通过PCR获得了嗜热母一葡萄糖苷酶基因，将其与表达载体pET24a(+)连接，成功构建了重组表达质粒pET24a(+)一PF0073。2)将该重组表达质粒转化到大肠杆菌E

6、coliRosetta中得到成功表达，优化其诱导表达条件后对其水解纤维二糖的酶学性质进行表征。得出，该重组B一葡萄糖苷酶的最适pH和温度为5．0和95℃，在pH4．0．8．0和80．90℃范围内，具有较好的pH稳定性和热稳定性。该重组p一葡萄糖苷酶的比酶活为222．94U／mg，动力学常数K。值为16．9mM，V。。为0．6279ixM／min。lmM的金属离子(如Li+、Ca2+、C02十等)和10mM的EDTA以及糠醛对其活性影响不大，其对乙醇的耐受性良好，Ki值达到150g／L，对葡萄糖的耐受性略差，Ki值为20

7、0mM。3)本研究发现，重组蛋白表达过程中形成具有水解纤维二糖能力的活性包涵体(BGL—AIBs)。在37。C和25℃条件下对BGL．AIBs的诱导表达条件进行优化，嗜热D·葡萄糖苷酶重组表达及纤维二糖水解特征研究得出两个温度下的最佳诱导表达条件均为OD600为1．2、诱导时间为14h、IPTG浓度为O．25mM，且两者相比37。C时BGL．AIBs的表达水平更高。然后初步研究BGL—AIBs的性质与结构特征。结果表明其基本酶学性质与重组p一葡萄糖苷酶的相似，特殊的是，BGL．AIBs具有很好的重复利用特性，重复使用6

8、次后其酶活还保留86．6％。BGL．AIBs为松散型包涵体，且其在约1620hm处具有B．折叠结构。关键词：Pyrococcusfitriosus，重组表达，嗜热p一葡萄糖苷酶，活性包涵体，纤维二糖儿江苏大学硕士学位论文Ex"gandcharacterizingthermophilicB．glucosidaseforExpress