葡萄WRKY26、WRKY27基因启动子克隆及功能分析

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2、本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。保密的学位论文在解密后使用本授权书。学位论文作者签名：社指导教师虢垒重堑塑皇签名日期：如／；年如弓J日辽宁师范大学硕士学位论文摘要欧洲葡萄(I巧tisviniferaL)作为葡萄属中最重要的～个品种，主要用作鲜食和酿酒，每年产量约占世界葡萄总产量的90％以上。但其抗逆性较差，易受环境变化和病虫害等逆境胁迫因素影响，故其产量与质量难以保证。研究表明，在植物逆境胁迫信号转导过程中，特异性转录因子与相关抗逆基因启动子的结合能够调控下游基因表达的时间和水平，进而提高植物的抗逆性。WR_KY蛋白是一类植物特有的转录因子家族，多数

3、研究表明该蛋白能够广泛参与多种生物与非生物胁迫防御反应。因此实验选取欧洲葡萄中的两个W／U【Y基因启动子(Va，WRKY26和阴，WRKY27)进行研究，分析两个矾，WRKY基因启动子的表达调控能力，为葡萄逆境胁迫响应机制的研究提供理论依据。利用欧洲葡萄全基因组序列数据库比对方法，分别选取起始密码子(ATG)上游约1500bp序列作为扩增目标。依据数据库序列信息设计引物，使用PCR扩增技术得到了欧洲葡萄阳，WRKY26、M，WRKY27基因启动子序列，其长度分别为1108bp、1381bp。使用植物启动子顺式作用元件分析数据库PlantCA_RE，对已扩增获得

4、的启动子序列进行顺式作用元件分析，结果表明VvWRKY26、VvWRKY27基因启动子序列包含多种参与植物发育、生物与非生物胁迫相关的响应元件，如激素类响应元件，水杨酸响应元件、茉莉酸响应元件；光敏感响应元件；热敏感响应元件；胚乳发育相关响应元件等。依据上述启动子顺式作用元件分析的结果，分别对VvWRKY26和VvWRKY27基因启动子设计不同的上游引物，利用5’端缺失方法扩增不同长度的启动子序列，分别命名为VvW26p一，、VvW26p．2、VvW26p．3、VvW26p．4以及VvW27p．J、VvW27p-2、VvW27p-3。通过酶切的方法，将VvWR

5、KY26和VvWRKY27基因启动子缺失片段分别替换pBI．221表达载体的35S启动子部分，构建新的瞬时表达载体。进一步采用PEG．Ca2+介导的方法，将重组表达载体分别转染至分离的拟南芥原生质体中培养。利用瞬时荧光表达技术，对报告基因LUC(Luciferasereportergene)的表达量进行检测，分析两个VvWRKY启动子的表达调控能力。结果表明，欧洲葡萄VvWRKY26、VvWRKY27基因启动子序列具有不同的促进和抑制区域，且每个区域均能调控报告基因的表达，此结果为后续的顺式作用元件分析提供了实验依据。关键词：欧洲葡萄；WRKY蛋白；启动子；瞬

6、时表达葡萄WRKY26、WRKY27基因启动子克隆及功能分析CloningandFunctionalAnalysisofHt／svinife，口WRKY26andWRKY27PromotersAbstractEuropeangrape(V／t／svmiferaL)asoneofthemostimportantspeciesofVitis，isusedfortablegrapeandthewine，anditsannualproductionaccountsforabout90％ofthetotalproductionofgrapesintheworld．Bec

7、auseofitspoorstressresistantability，VitisvinifeyaLisvulnerabletotheinjuriesofenvironmentalchangeandinsectpests．Theyieldandqualityaredifficulttobemaintained．Theresearchesshowedthat,intheprocessofplants’stressresponse，thebindingandregulationsofspecifictranscriptionfactorstostressresis

8、tancegenepromotersr