原因不明复发性流产母胎界面调节性T细胞对NK细胞的功能调控

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1、上海交通大学博士学位论文原因不明复发性流产母胎界面调节性T细胞对NK细胞的功能调控姓名：鲍时华申请学位级别：博士专业：妇产科学指导教师：林其德20090401鲍时华2006级博士研究生学位论文中文摘要胚胎对于母体来说是半同种异体移植物，母体免疫系统能否识别并耐受胚胎抗原，将直接影响妊娠的结局。这说明母胎间存在着免疫耐受，它受母胎界面局部免疫和孕妇系统免疫的共同调控，特别是母胎界面局部免疫，一旦这种母胎免疫耐受机制紊乱，URSA及其他病理妊娠就有可能发生。CD4+CD25+Treg细胞作为有免疫抑制功能的细胞群体，在维持妊娠期母胎免疫耐受平衡中扮演着重要角色，Treg细胞数量和功能

2、的异常会引起母胎免疫耐受的失衡。但以CD4+CD25hj曲或CD4十CD25+Foxp3+亚型作为其分子标志，并不能真实反应体内Treg细胞的水平。IL．7R(CDl27)是T淋巴细胞膜表面受体，在Treg细胞中低表达或不表达，与Foxp3表达呈正相关，低表达CDl27的Treg细胞同样具有抑制自身效应T细胞的能力，是新的更为理想的Treg细胞表面分子标志。以此为标记的Treg细胞的数量和功能变化对URSA患者蜕膜局部免疫耐受环境的影响，目前尚无相关研究。蜕膜NK细胞在母体免疫系统对胎儿同种抗原的识别中也有至关重要的作用。作为维持母胎免疫耐受的两类主要免疫细胞，Treg细胞和NK

3、细胞的数量和功能的平衡有利于正常妊娠的继续。随着对Treg细胞功能研究的深入，其对NK细胞功能的调控也渐受关注，在URSA中Treg细胞是否能够引起NK细胞功能变化，目前尚无文献报道。本课题主要以CD4+CD25+CDl27di阱为Treg细胞的表面标记，从URSA患者蜕膜Treg细胞和NK细胞的表达频率和功能变化为契入点，期望通过实验研究，能够揭示URSA母胎界面Treg细胞对NK细胞的功能调控机制，阐明它们在免疫耐受失衡导致流产中的作用机理。1．蜕膜CD4+CD25+CDl27di州1reg细胞的分离和体外扩增探讨CD4+CD25+CDl27d酬‘作为蜕膜Treg细胞分子标志

4、的有效性及优势。以CD4+CD25+CDl27Ⅲ舭三抗原标记法作为识别蜕膜Treg细胞的分子标志，用MACS分离纯化CD4+CD25+CDl27dim／-Treg细胞，在体外用anti．CD3+anti．CD28+IL．2进行扩增培养，采用实时荧光定量RT．PCR和FCM分析CD4+CD25+CDl27dim／"Treg细胞胞内Foxp3表达，用FCM检测CD4+CD25MgII、CD4+CD25+Foxp3+和CD4+CD25+CDl27dinV-Treg细胞在正常早孕人流妇女蜕膜淋巴细胞中的表达频率。结果显示：从蜕膜中分离出的CD4+CD25+CDl27Ⅲm／-Treg细胞可

5、在体外扩增，2周内细胞数量可扩增50倍，扩增后的CD4+CD25十CDl27dinVTreg细胞表型稳定，纯度可达91．11％；扩增后的CD4十CD25+CDl27dim／-Treg细胞胞内高表达Foxp3；正常早孕人流妇女蜕膜淋巴丝堕坐兰QQ鱼丝监主塑塑生堂焦迨塞主塞塑塞细胞中CD4+CD25+CDl27dim／-Treg细胞表达频率为2．970／牡1．19％，CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞表达频率为2．020／o_+0．83％，CD4+CD25m曲Treg细胞表达频率仅为1．60％+0．80％；CD4+CD25+CDl27dinv-Treg细胞表达频率显著高于CD

6、4+CD25+Foxp3+和CD4+CD25蚴Treg细胞表达频率，CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞表达频率显著高于CD4+CD25岫Treg细胞表达频率。CD4+CD25+CDl274耐’是新鲜分离和体外扩增培养Treg细胞的有效标志，以此为标志能更加准确全面地反映体内Treg细胞水平，并便于分选获得大量Treg细胞，为Treg细胞的功能研究奠定基础。2．URSA蜕膜CD4+CD25+CDl27d耐-Treg细胞的表达频率和功能研究比较CD4+CD25+CDl27dⅢ“Treg细胞在正常早孕妇女与URSA患者蜕膜中的表达频率和功能变化，揭示CD4+CD25+CDl27

7、0耐'Treg细胞对URSA患者蜕膜局部免疫耐受环境的影响。留取URSA组(URSA患者21例)和对照组(正常早孕人流妇女30例)蜕膜组织，并制备成DMC，采用FCM分析两组蜕膜CD4+CD25+CDl27ainu-Treg细胞的表达频率及CD4+CD25+CDl27m州meg细胞胞内Foxp3，IL．10和TGF．B表达水平；体外增殖试验检测CD4+CD25+CDl27dim／-Treg细胞对自身效应T细胞的增殖抑制功能；通过体外培养抗体封闭，观察IL-10和TGF．D在介导C